木犀草素检测方法研究进展

施 敏，杨莉莉，鲍昌昊，马雯雯，程 寒,2*

(1.中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074；2.中南民族大学 民族药学国家级实验教学示范中心，湖北 武汉 430074)

木犀草素化学名称为3′,4′,5,7-四羟基黄酮(3′,4′,5,7-tetralydroxyflanone)，分子式为C15H10O6，分子量为286.23，熔点为328～330 ℃，基本结构如图1所示，是一类具有典型C6-C3-C6结构的天然黄酮类化合物，也是一种天然色素组分，存在于金银花、白毛夏枯、紫苏叶、菊花、青兰、芹菜、香菜、花生壳、胡萝卜和石榴[1]等植物材料中。木犀草素微溶于水，能溶于乙醚、乙醇，难溶于冷水，其热水溶液呈淡黄色，易溶于10%氢氧化钠水溶液并呈深黄色，能与金属离子生成带色的络合物。因它的分子中存在4个酚羟基(见图1)，故亲脂性较差，其水溶液具有弱酸性，可以在电极上发生氧化还原反应，具有电化学活性。

图1 木犀草素的结构式Fig.1 Structure of Luteolin

木犀草素的药理活性主要表现在抗菌、抗炎、抗过敏、抗氧化、抗肿瘤[2-7]等方面，在临床上主要用于止咳、祛痰、治疗心血管系统、保护肝脏、免疫调节和保护神经系统[8]等。如木犀草素对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等具有较好的抑菌效果[9]，可减轻急性痛风性关节炎的炎症反应[10-11], 可应用于胃癌治疗或协同增效[12]，还能给通过靶向抑制小鼠肺癌移植瘤，增强荷瘤小鼠的免疫功能从而改善其生存状况[13]。

因此，建立木犀草素的检测方法对于黄酮类化合物在药物分析中的研究与应用具有重要意义。本文综述了木犀草素检测的分析方法研究进展，以期为其在医药、食品等工业中的开发利用和深入研究提供参考。

1 木犀草素的测定方法

目前，木犀草素的测定方法主要有高效液相色谱法[14]、毛细管电泳法[15]、紫外分光光度法[16]以及直接电化学法[17]等，其优缺点如表1所示。这些方法普遍都存在一些不足，比如线性范围较窄或制备过程较繁琐。

表1 木犀草素测定方法的优缺点

1.1 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(表2)是木犀草素检测的重要手段。Khuluk等[18]采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)对山楂进行了研究，将HPLC-DAD指纹图谱分析与化学计量学相结合，应用甲醇和0.2%甲酸水进行梯度洗脱，结果成功得到了8种黄酮类化合物(东方素、金丝桃苷、芦丁、杨梅素、木犀草素、槲皮素、山奈酚和芹菜素)，其检出限和定量限分别为0.006～0.015 mg/L和0.020～0.052 mg/L，准确度在97%～105%之间，相关系数为(r2)>0.999。王梅等[19]对追风蒿不同药用部位中的木犀草素进行含量测定，实验测得花叶、茎、根木犀草素含量分别为0.18%、0.13%、0.03%。朱金花等[20]用HPLC法同时测定忍冬叶中木犀草素和槲皮素等9种活性成分，结果显示在乙腈-0.5%醋酸水溶液条件下，各个成分在45 min内得到良好分离，且在327 nm处均有吸收，该品种的忍冬叶中木犀草素的含量相对较低，槲皮素可能不含或含量极微。Mai等[21]采用超高效液相色谱法(UPLC)和高效液相色谱法(HPLC)对龙眼叶片中的5个组分(没食子酸乙酯、黄芪、槲皮素、木犀草素、山奈酚)进行定量分析，以甲醇0.2%磷酸作为流动相进行梯度洗脱，并首次运用单指标定量分析(QAMS)测定了龙眼叶片的含量，结果测得其RSD<2.28%，为建立龙眼叶片多指标质量控制奠定了基础。

木合塔尔·吐尔洪等[22]对新疆库鲁木提草中柚皮苷和木犀草素两种活性成分进行同时测定，以甲醇-0.2% HAc水溶液作为流动相进行洗脱，研究结果表明两种活性成分之间以及它们与干扰组分能良好分离，且野生库鲁木提草中柚皮苷和木犀草素的含量更高。李锐等[23]为优化紫苏种子中总黄酮的提取方法，采用高效液相色谱法(HPLC)测定了不同地区的紫苏种子中芦丁和木犀草素的含量，通过对提取液浓度、提取时间、提取温度等条件进行优化，结果发现参试的4个不同地区的紫苏种子总黄酮含量差异极显著(F=17.592 0，P=0.000 7)，为后续木犀草素的研究提供了有价值的实验依据和参考方法。王艳艳等[24]采用HPLC法同时测定不同月份采摘的忍冬叶中木犀草素和木犀草苷，以乙腈-0.5%冰乙酸为流动相，梯度洗脱后于350 nm波长下进行检测。结果显示木犀草素、木犀草苷含量分别在11月(0.75 mg/g)和6月(6.05 mg/g)达到最高。王柯等[25]用HPLC法对河南封丘县金银花4个部位(花、叶、茎的表皮、茎)中的木犀草素和木犀草苷进行含量测定，成功在金银花的花、叶和茎的表皮中检测到木犀草素。Dong等[26]采用HPLC-UV方法用于同时测定大鼠口服洋甘菊后血浆中的槲皮素、木犀草素和芹菜素，先以甲醇：0.2%磷酸体积比1∶1进行提取，并运用UV法在350 nm处测其吸光度，测得最大血浆浓度(C最大值)为0.29±0.06、3.04±0.60和0.42±0.10 mg/L，定量下限为0.11 mg/L，且成功应用于槲皮素、木犀草素和芹菜素在大鼠血浆中洋甘菊提取物的药代动力学研究。

解军波等[27]建立液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)检测独一味中木犀草素的含量，以甲醇-0.1%醋酸水(80∶20)的比例进行洗脱分离，结果表明木犀草素在5～160 μg/L范围内线性关系良好，平均加样回收率为99.27%。戴芸等[28]采用液相色谱-单级质谱联用法(LC-MS)实现了花生壳中木犀草素的含量测定，在50～2 000 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系，r2=0.995 8，平均回收率为97.70%。丁建中等[29]采用Q-TRAP型液相色谱-质谱/质谱法(Q-TRAP LC-MS/MS)对杏苏散水提液中苦杏仁苷、芦丁、木犀草素和白花前胡乙素这4种成分进行定量分析，测得苦杏仁苷、芦丁、木犀草素和白花前胡乙素的含量分别为63.18、0.47、1.65和0.13 mg/L。胡莹等[30]采用液相色谱-质谱/质谱联用方法(LC-MS/MS)同时测定金樱子中7种主要成分(蔷薇酸、原儿茶酸、没食子酸、木犀草素、山柰素、槲皮素和芦丁)的含量，实验结果表明不同产地金樱子各成分含量方面存在差异，相关系数r2在0.990 8～0.997 8之间。

表2 HPLC法测定木犀草素

1.2 紫外分光光度法(UV)

采用紫外分光光度法测定木犀草素已有较多报道。王柯等[31]用三波长分光光度法测定金银花及叶中总黄酮，测得总黄酮相关系数为r=0.999 4；平均回收率分别为96.6%、97.1%，RSD=1.4%、2.3%(n=4)。王春红等[32]利用紫外分光光度法和高效液相色谱法测试乌拉草提取液中抗菌物质木犀草素的含量，并对2种测试结果进行比较，通过体外抗菌法对提取液进行抗菌性能研究，发现在350 nm波长处有最大吸收，木犀草素的质量浓度随着提取溶剂中水的比例的增大而逐渐减少。Zou等[33]研究了引入DNA前后的木犀草素的电化学性质，并利用紫外可见分光光度法与荧光光度法等方法比较了木犀草素与DNA作用前后的光谱分析结果，发现木犀草素与DNA的相互作用为嵌入模式。

朱欣等[34]通过乙醇回流法提取花生壳，用纤维素酶进行酶解得到提取液，以提取率为指标，分别考察了料液比、酶用量、酶解时间等对其含量的影响，并通过紫外分光光度计在波长为408 nm处准确测到了木犀草素的最大吸光度，成功通过纤维素酶法提取了花生壳中的木犀草素。Sandu等[35]采用紫外-可见光谱、荧光光谱结合分子对接等技术，研究了木犀草素、芦丁和芹菜素三种黄酮类化合物与人血清转铁蛋白(HST)的结合机制和亲和力，结果表明这三种黄酮类化合物的结合增加了HST的稳定性，且和HST之间存在的相互作用是使HST荧光猝灭的静态过程，芦丁和木犀草素与HST为疏水性结合，芹菜素与HST为静电性结合，为HST在黄酮和其他药物靶向给药中的潜在应用提供一种新的可能。

1.3 毛细管电泳法(HPCE)

除了UV法和HPLC法，毛细管电泳法(表3)也被用来分析木犀草素。Honegr等[36]采用HPCE法测定植物提取物中的芦丁、芹菜素、木犀草素和槲皮素，并利用LVSSPS(Large volume sample stacking with polarity switching)进行富集，分别实现了77、87、93和68倍的富集因数。田晶晶等[37]利用毛细管电泳分离4种黄酮类化合物，在分离电压为18 kV的条件下，4种物质在7 min内得到了良好的分离，证明该方法能实现对中药菟丝子和珍菊降压片中芦丁、槲皮素、山奈酚、木犀草素4种黄酮类化合物的分离测定。王敦青等[38]采用一种极性转换大体积样品堆积-区带毛细管电泳法分析了鸡冠花水煎液中的山奈酚、木犀草素和槲皮素，结果测得该方法的灵敏度提高了60～96倍，检出限为55.3～75.8 μg/L，鸡冠花实际样品的回收率为82%～114%，能用于天然药犀草物中这3种黄酮类化合物的分析。Sanli等[39]提取了豆角中的多酚类化合物，采用毛细管电泳-二极管阵列检测方法用于不同豆角样品中18种多酚类化合物的鉴别和测定，并考察了分离电压和缓冲液pH值对分离效果的影响，结果在不使用有机改性剂的情况下，在17分钟内能实现对12种化合物的测定和18种化合物的分析，该方法能成功地应用于角豆样品中没食子酸、香草酸、龙胆酸和木犀草素等4种主要成分的同时测定。

余丽双等[40]采用毛细管电泳-安培检测法(CE-AD)对蒙花苷、刺槐素、木犀草素和芹黄素四种黄酮类化合物进行分离分析,在pH=9.00，60 mmol/L Na2B4O7-120 mmol/L NaH2PO4缓冲溶液中，测得四种黄酮类化合物的检出限(S/N=3)为0.2～0.005 mg/L。吴婷妮[41]运用区带毛细管电泳法分离9种生物活性黄酮(蒙花苷、木樨草苷、金合欢素、表儿茶素、儿茶素、香叶木素、木樨草素、芹菜素和山奈酚)，研究了紫外检测波长、缓冲液pH、缓冲液浓度、进样时间和分离电压等实验参数对分离、检测的影响，结果发现在20 mmol/L硼砂-50 mmol/L磷酸二氢钠(pH 9.6)的缓冲液中，紫外检测波长为330 nm，分离电压为15 kV时，9种黄酮类化合物在30 min内可实现良好分离。

表3 HPCE法测定木犀草素

1.4 直接电化学法(EA)

光谱法、色谱法、毛细管电泳法等均可用于木犀草素的检测，但这些方法都存在程序繁琐、仪器昂贵、实验要求条件高、重现性差等问题。直接电化学法(表4)则具有灵敏度高、选择性好、准确度高、测量范围广、仪器设备简单等特点，逐渐成为一种不可或缺的测定中药有效成分含量的方法。Li等[42]应用方波伏安法研究了木犀草素在BNNS-AuNPs修饰玻碳电极上的电化学行为，在实际样品分析中，首次采用电化学方法成功测定了紫苏中木犀草素的含量，为木犀草素药物质量控制和检测提供一种简便快速的新方法。而化学修饰电极的出现极大地拓展了传统电化学的研究范围，在药物分析领域有着广阔的应用前景。

表4 EA法测定木犀草素

1.4.1 以石墨烯为修饰材料检测木犀草素

石墨烯是一种以sp2杂化链接的碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状晶格结构的新材料，石墨烯及其复合材料的大比表面积、优良的吸附性能、高电子迁移率等优点，为电化学检测木犀草素提供一种新的选择。

Xu等[43]则利用二硫化钼(MoS2)的高催化性和石墨烯碳纳米管(GN-CNT)优良的导电性，采用水热法制备了MoS2/GN-CNT纳米复合材料，结果发现该纳米复合材料对木犀草素表现出较高的电化学敏感度。赖文婷等[44]将正己基吡啶六氟磷酸盐与石墨粉混合制备修饰电极，通过电化学沉积石墨烯修饰电极来检测木犀草素，采用循环伏安法和示差脉冲伏安法研究了木犀草素在修饰电极上的电化学行为。实验结果表明，在pH=2.0的磷酸缓冲液中，修饰后的电极对木犀草素的电化学氧化具有良好的催化作用，其浓度在4.0×10-8～4.0×10-6mol/L之间与氧化峰电流呈良好的线性关系，检测限为1.0×10-8mol/L。Wu等[45]釆用β-环糊精功能化石墨烯/金纳米粒子修饰玻碳电极，利用环糊精较高的富集作用以及环糊精与木犀草素的主-客体相互作用，在探究其电化学特征后对人血清中的木犀草素含量进行了测定，结果测得其浓度范围为10.0 pmol/L～10.0 μmol/L，检测限为3.3 pmol/L(S/N=3)。

You等[46]将磁性分子印迹聚合物与还原氧化石墨烯相结合检测了天然提取物中的木犀草素，结果发现，这种新型复合材料能明显增强其协同催化作用，能更高效、快速地用于木犀草素的含量测定。温校勇等[47]通过滴涂法制作了钯-石墨烯复合材料修饰电极，采用循环伏安法和示差脉冲伏安法研究了木犀草素在电极上的电化学行为，在优化条件下木犀草素的氧化峰电流与其浓度在1.0×10-9～1.0×10-6mol/L内存在线性关系，检测限为0.33 nmol/L(3σ)。利用本方法对独一味胶囊中木犀草素的含量进行测定，测得其回收率在95.6%～104.8%范围内，相对标准偏差(RSD)低于3.43%。Wang等[48]则利用锆金属有机骨架UiO-66/还原氧化石墨烯复合材料修饰玻碳电极(UiO-66/ErGO/GCE)测定了木犀草素，并对pH、富集时间和扫描速率等影响电化学行为的因素进行了评价和优化，结果发现木犀草素在浓度范围为0.001～20 μmol/L之间出现了形状良好的氧化还原峰，检出限为 0.75 nmol/L，稳定性和重现性较好，其检测结果与实际预期相符，可用于木犀草素的定量测定。

1.4.2 以碳纳米管为修饰材料检测木犀草素

碳纳米管是一种尺寸在5～50 nm的新型纳米材料，由石墨烯片层卷曲而成，分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管两种类型，具有良好的导电性、稳定性、大比表面积和超常机械强度等特点。碳纳米管修饰电极可以有效加速物质的电子交换，常被应用于电极修饰材料。

白小慧等[49]用纳米氧化镍/单壁碳纳米管(NiOx/SWCNTs)修饰玻碳电极对砂珍棘豆中木犀草素含量进行了测定，运用方波伏安法和循环伏安法研究其电化学行为，结果表明在 pH 2.8±0.2的伯瑞坦-罗宾森缓冲溶液中，木犀草素在修饰电极上的氧化、还原峰电位均负移，峰电流明显增加，其样品回收率为98.69%～104.40%，相对标准偏差为 1.05%～1.37%，表明该方法可用于砂珍棘豆中木犀草素的含量测定。FENG等[50]制作了羟基磷灰石-碳纳米管(HAP-CNT)修饰玻碳电极，研究了木犀草素在HAP-CNT/GCE上的电化学行为，通过优化测定参数，测得其线性范围为：4.0×10-7～1.2×10-5mol/L，检出限达到8×10-8mol/L。WEN等[51]制备了多壁碳纳米管/聚-3,4-亚乙基二氧噻吩和金纳米粒子复合材料修饰玻碳电极(MWCNTs/PEDT-Au/GCE)检测木犀草素，结果表明MWCNTs/PEDT-Au能够有效地促进木犀草素和电极之间的电子传递，对于木犀草素的氧化还原具有良好的电催化效果。

尚永辉等[52]采用循环伏安法、差分脉冲法研究了木犀草素在多壁碳纳米管修饰电极上的电化学行为，并进一步探究了木犀草素与DNA的相互作用，在pH 3.29的B-R缓冲体系中，其峰电流与木犀草素浓度在5.0×10-8～1.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，且木犀草素电化学信号随着DNA的浓度增加而逐渐降低，证明了木犀草素与DNA的相互作用是以嵌入方式为主。Tang等[53]制作了一种新型的聚(结晶紫)/多壁碳纳米管修饰电极，用循环伏安法等方法对其电化学行为进行表征，结果发现MWCNTs(多壁碳纳米管)的大比表面积、PCV纳米薄膜的电子转移优势和强相互作用协同改善了木犀草素的氧化还原峰值电流，其氧化峰电流随木犀草素的浓度在2.0×10-8～7.0×10-5mol/L范围内呈线性增加，检测限为5.0 nmol/L(S/N=3)，并成功应用于菊花中木犀草素的检测。

1.4.3 其他修饰材料检测木犀草素

量子点是一种重要的低维半导体材料，可以通过调节纳米半导体的尺寸来控制它的发光颜色，具有限制电子和电子空穴的特性。

Tang等[54]用GQDs/GNPs(石墨烯量子点/金纳米粒子)纳米复合材料修饰电极对木犀草素进行检测，发现修饰材料具有优异的电催化活性作用，使木犀草素在pH 5.0磷酸盐缓冲液中的氧化电流增加了16倍。通过微分脉冲伏安法研究了氧化电流与浓度的关系，其在1×10-8～1×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，回归系数为0.997，检出限为1.0 nmol/L(S/N=3)，花生壳样品中木犀草素测定的回收率在98.8%～101.4%之间。高叶等[55]通过水热法合成了碳量子点，并将碳量子点和溴甲酚绿分步电聚合于玻碳电极表面，制成聚溴甲酚绿/碳量子点(PBG/CQDs)修饰电极，并对中药胶囊中木犀草素含量进行测定，测得氧化峰电流与木犀草素浓度在0.010～15.0 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检测限达到4.0 nmol/L，其测定结果与高效液相色谱法结果一致。而电极经过导电聚合膜修饰后可增加电极表面的传质速率，在电化学检测中的应用也颇受关注。

Xie等[56]采用一种新型核壳结构的磁性共价有机框架(Fe3O4@TAPB-DMTP-COFs)作为修饰材料，研究木犀草素在修饰电极上的电化学行为及其电极反应机理，TAPB-DMTP-COFs不仅提供了更多的活性中心，而且避免了Fe3O4的聚集，Fe3O4磁性纳米颗粒能明显加速电子传递，提升电化学传感器的性能。该方法测得其检测限为0.007 2 μmol/L，线性范围为0.010～70 μmol/L，为检测木犀草素含量建立一种电化学分析新方法。

Niu等[57]以板岩叶为原料，采用水热法制备了金纳米薄片(AuNFs)修饰的生物质多孔炭(BPC)，得到AuNFs-BPC纳米复合修饰材料并用于木犀草素的测定，测定结果表明木犀草素的电化学信号与裸电极相比明显增强，且能实现在独一味胶囊和人尿样中木犀草素的测定。Xu等[58]利用MXene/ZIF-67/CNTs(新型的二维过渡金属钙钛矿或氮化物纳米材料/咪唑啉分子筛骨架-67/碳纳米管)复合材料电化学检测木犀草素，测得其线性范围为0.1～1 000 nmol/L，检测限为0.03 nmol/L (S/N=3)，准确测定了实际样品中的木犀草素。

Wei等[59]制备了一种新型的分子印迹聚合物(MIP)电化学传感器，采用电聚合方法在ITO玻璃电极表面电沉积β-环糊精(β-CD)作为MIP膜，并以木犀草素作为模板分子进行检测，测得木犀草素浓度的线性响应范围为5.0×10-8～3×10-5mol/L，检出限为2.4×10-8mol/L(S/N=3)，且应用于中药中木犀草素的检测时准确度和精密度较好。

2 结论与展望

综上所述，测定木犀草素含量的方法已经有大量的报道，但这些方法大多有自己的缺点，如仪器昂贵、实验过程复杂等。直接电化学法具有灵敏度高、重现性好、操作更简便、成本更低等优点，能更加高效准确的对木犀草素进行测定。而在未来，开发更灵敏、快速的电化学传感器仍将成为研究的热点，随着电化学传感器的不断发展，直接电化学法将更好地应用于木犀草素的含量测定和质量控制。