微生态制剂调控比格幼犬生长性能和肠道菌群的研究

王志华，贾俊鹏，RADEBE Stoffel Matjeke，庾庆华

(南京农业大学动物医学院，南京 210018)

犬是人类最重要的伴侣宠物，与人相比，犬更易受到食物污染、病原微生物和应激等多因素侵害，导致炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、肠应激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)等肠道疾病产生。微生态制剂(microecologics)是利用益生菌活菌、死菌或其代谢产物制备，用于调整微生态失调，保持微生态平衡，提高机体健康水平，以达到防病、治病效果的制剂。微生态制剂主要用于治疗动物胃肠道疾病和提高经济动物的生产性能[1-2]。关于微生态制剂用于犬类的研究，Lee等[3]将分离自犬粪便的嗜酸乳杆菌HY7032(LactobacillusacidophilusHY7032)和罗伊氏乳杆菌HY7506(LactobacillusreuteriHY7506)混合制备微生态制剂，并对注射了万古霉素和多黏菌素的6月龄比格犬连续灌喂该制剂3周，发现该微生态制剂能显著改善抗生素引起的菌群失调，同时改善毛发质量。 Xu等[4]对40只不同年龄腹泻犬使用干酪乳杆菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang)、植物乳杆菌P8(LactobacillusplantarumP8)和乳双歧杆菌V9(Bifidobacteriumsp.lactisV9)制备的微生态制剂，发现该微生态制剂可以显著改善病犬的腹泻症状，调整其肠道菌群。但是上述报道都仅关注2月龄以上的断奶犬，对于2月龄以下哺乳期幼犬，灌喂益生菌后其生理状态改变状况的研究鲜见报道。肠道菌群平衡于生命早期建立[1]，肠道细菌定植的关键阶段是在出生后至断奶期间。由于幼犬免疫系统发育不完善，肠道菌群结构不稳定，通过饮食摄入益生菌对幼犬菌群的影响更大，故哺乳期幼犬肠道健康尤其值得关注。本研究利用微生态制剂灌喂哺乳期比格幼犬，综合评价微生态制剂对比格幼犬正常生长发育的影响，同时对幼犬粪便进行菌群16S rDNA测序，检测多样性和丰度，研究微生态制剂对幼犬肠道菌群的影响，为今后深入探究微生态制剂调控幼犬生长性能和肠道菌群的具体机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微生态制剂 试验用复合微生态制剂购自南京谷登宠物用品有限公司，其组成包括动物双岐杆菌(Bifidobacteriumanimalis，1.3×109CFU/g)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，3.5×109CFU/g)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis，5.0×108CFU/g)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus，1.0×108CFU/g)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，8.0×108CFU/g)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans，2.0×109CFU/g)、果寡糖、L-精氨酸、牛磺酸、DL-α-生育酚乙酸酯、D-泛酸钙、葡萄糖和糊精。益生菌总菌量为6.0×109CFU/g，除益生菌外其余成分总和≤0.1%。

1.1.2 试验动物 试验所用比格犬购自仪征安立卯生物科技有限公司。 选取15日龄比格犬12只(由2只健康母犬第一胎次分娩)，初体重(717±84)g。

1.1.3 主要试剂及仪器 免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、犬白介素-1β(IL-1β)、脂多糖(LPS)等ELISA试剂盒均购自江苏酶联生物科技有限公司；TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒购自北京诺禾致源生物科技有限公司。酶标仪(Multiskan FC)购自赛默飞公司；Illumina NovaSeq 6000测序平台购自北京诺禾致源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组处理及样品采集 12只比格犬随机分为对照组(Control，n=6)和微生态制剂组(Probiotics，n=6)。对照组和微生态制剂组幼犬分别由奶水充足的健康母犬母乳喂养，母犬处于同一饲养管理环境，每只母犬各自喂养同一组6只幼犬，不限制幼犬与母犬的接触。 每天09:00每只对照组幼犬灌喂20 mL生理盐水，微生态制剂组灌喂20 mL微生态制剂溶液(18 g微生态制剂溶于20 mL生理盐水)，每日灌喂益生菌总菌量约为1.08×1011CFU。第28天每只犬挑取2～3 g粪便置于无菌冻存管中，并于-80 ℃保存待检。 同时各组犬禁食12 h。 禁食结束，对12只犬经后肢隐静脉空腹采血0.5 mL于肝素抗凝管中，4 ℃保存待检。同时采血2 mL于真空促凝管中，1 200 r/min离心5 min，分离血清，-20 ℃待检。

1.2.2 生长性能检测 于试验0、3、9、12、15、18、21、25、28 d 08:00称量12只犬的空腹体重，并计算净增重。

净增重=当日称重量-0 d称重量

1.2.3 血液学指标测定 将0.5 mL抗凝血样送至南京农业大学动物医院，使用ABX MICROS 60全自动三分类血细胞分析仪对犬血液进行红细胞计数(RBC)和血红蛋白(HGB)浓度测定；将1 mL血清样送至南京农业大学动物医院，使用爱德士Catalyst Dx 生化分析仪检测犬血清中碱性磷酸酶(AKP)、无机磷(IP)、总胆固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)含量。

1.2.4 血清免疫指标测定 使用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测犬血清中IgA、IgG、IL-1β和LPS含量。在预先包被捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HR标记的检测抗体，进行温育并彻底洗涤。用四甲基联苯胺(TMB)显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色，用酶标仪测定D450 nm值，计算样品浓度。

1.2.5 肠道菌群16S rDNA测序 采集幼犬粪样后送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16S rDNA高通量测序分析。首先采用SDS法对样本的基因组DNA进行提取，使用无菌水稀释样本至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，对模板的16S V4区进行PCR扩增(引物806R：5′-GG-ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；515F：5′-GTG-CCAGCMGCCGCGG-3′)得到PCR产物。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit进行文库构建，文库合格后，对PCR产物使用NovaSeq 6000平台进行上机测序，得到下机数据。根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，对数据进行拼接、过滤得到有效数据(Clean data)。然后基于有效数据进行聚类，默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units)，并对OTUs序列进行物种注释。对不同样本在97%一致性阈值下的Alpha多样性分析指数(Goods coverage、Observed species、Shannon)进行统计，并基于Weighted Unifrac距离对样本进行PCoA分析。用Mothur方法与SILVA138(http:∥www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得分类学信息并分别统计各样本的在门(phylum)、属(genus)、种(species)水平上的物种分布情况。

1.3 统计学分析

用SPSS 22.0统计软件进行独立样本t检验，结果用平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 微生态制剂对比格幼犬生长性能的影响

灌喂微生态制剂后，30～43日龄微生态制剂组幼犬体重均显著高于对照组(P<0.05，图1A)；15～43日龄微生态制剂组幼犬净增重显著高于对照组(P<0.05，图1B)。

①A，比格幼犬15～43日龄体重变化；B，比格幼犬15～43日龄净增重。②*,差异显著(P<0.05)；无标记，表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 微生态制剂对比格幼犬血液学指标的影响

微生态制剂组比格幼犬RBC数及血清HGB、AKP和IP含量均显著增高(P<0.05)；微生态制剂组比格幼犬血清TCHO与对照组无显著差异(P>0.05)，血清TG显著降低(P<0.05)(图2)。

图2 比格幼犬血液学指标

2.3 微生态制剂对比格幼犬血清免疫指标的影响

与对照组相比，微生态制剂组比格幼犬血清中LPS、IL-1β、IgG、IgA含量均无显著差异(P>0.05，图3)。

图3 比格幼犬血清免疫学指标

2.4 比格幼犬肠道菌群测序结果

2.4.1 菌群测序信息统计及多样性分析 Goods coverage指数为本次测序结果的样本覆盖度，由图4A可知，对照组与微生态制剂组的Goods coverage指数均高于0.990，提示本次菌群测序已经基本涵盖样本中的所有物种信息，数据具有可信度。由图4B可知，微生态制剂组比格幼犬肠道菌群Observed species指数显著高于对照组(P<0.05)，提示微生态制剂组比格幼犬菌群物种丰富度显著增加；由图4C可知，微生态制剂组比格幼犬菌群Shannon指数高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。由图4D可知，微生态制剂组和对照组样本群落处于不同区域，两组样本群落结构置信区域只有小部分重叠，提示微生态制剂会对比格幼犬肠道菌群结构造成很大改变。

A，Goods coverage指数箱形图；B，Observed species指数箱形图；C，Shannon指数箱形图；D，基于Weighted Unifrac 距离PCoA主坐标分析，横坐标表示一个主坐标成分，纵坐标表示另一个主坐标成分，百分比表示主成分对样本差异的贡献值；图中的每个点表示一个样本，每个椭圆为各组样本的95%置信椭圆，同一组的样本使用同种形状表示

2.4.2 微生态制剂对比格幼犬肠道菌群门水平物种构成的影响 由图5可知，在门水平上，幼犬肠道菌群主要为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroides)、梭杆菌门(Fusobacteriota)等。与对照组相比，微生态制剂组比格幼犬肠道菌群中拟杆菌门和放线菌门相对丰度显著降低(P<0.05)；酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度显著增加(P<0.05)。

A，门水平前十物种相对丰度堆积柱状图；B，门水平主要物种相对丰度比较

2.4.3 微生态制剂对比格幼犬肠道菌群属水平物种构成的影响 由图6可知，在属水平上，幼犬肠道菌群主要为Escherichia-Shigella、链球菌属(Streptococcus)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、梭菌属(Clostridiumsensustricto1)、乳杆菌属(Lactobacillus)等。 与对照组相比，微生态制剂组比格幼犬肠道菌群Escherichia-Shigella、霍尔德曼氏菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和布劳特氏菌属(Blautia)相对丰度均显著降低(P<0.05)；梭菌属、梭杆菌属(Fusobacteria)、乳球菌属(Lactococcus)和片球菌属(Pediococcus)相对丰度显著增加(P<0.05)。

A，属水平前十物种相对丰度堆积柱状图；B，属水平主要物种相对丰度比较

2.4.4 微生态制剂对比格幼犬肠道菌群种水平物种构成的影响 由图7可知，在种水平上，幼犬肠道菌群主要为大肠杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、巴黎链球菌(Streptococcuslutetiensis)、Fusobacteriummortiferum和短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)等。与对照组相比，微生态制剂组比格幼犬肠道菌群大肠杆菌和短双歧杆菌相对丰度均显著降低(P<0.05)；犬大肠梭菌(Clostridiumcolicanis)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、Vagococcusteuberi、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)和死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)相对丰度均显著增加(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 微生态制剂对比格幼犬体重的影响

本试验中，灌喂微生态制剂的比格幼犬体重显著增加，推断该微生态制剂提高了处于发育期的比格幼犬对犬母乳的消化吸收水平。 朱群等[5]对乳仔猪连续灌喂1×109CFU干酪乳杆菌和粪肠球菌，发现灌服益生菌能显著提高仔猪的平均日增重，与本试验结果一致。 Cui等[6]在8周龄猪的玉米豆粕饲料中添加4.0×1011CFU/kg的枯草芽孢杆菌,发现枯草芽孢杆菌能显著提高猪的平均日增重并降低料重比。 Biourge等[7]对5～10岁德国向导犬和德国牧羊犬灌喂7.5×108CFU酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、Sun等[2]对1～2岁的比格幼犬灌喂3.0×109CFU的WeissellacibariaJW15均未影响到试验组犬对饲料干物质、粗蛋白质和脂质的消化能力，与本试验结果存在差异。犬摄取益生菌后，在消化吸收水平上存在较大差异，可能与服用益生菌种类、所处生理阶段及食用饲粮类型等因素有关。

3.2 微生态制剂对比格幼犬血液学指标的影响

血液学指标可以反映犬的生理状态和免疫系统状态。当体内外环境发生一定变化时，内环境稳态平衡被打破，机体内相关指标随之变化[8]。红细胞是血液运输氧气的主要媒介，通过HGB与氧气结合，使氧气到达全身。本试验结果表明，微生态制剂组比格幼犬血液红细胞数、HGB量均显著增高，说明其血氧容量得到提高。AKP广泛分布于动物肝脏、骨骼、肠、肾脏和胎盘等组织，经肝脏向胆外分泌，血清中AKP活性可以反映动物生长速率和生产性能[9-10]。无机磷与动物机体骨骼发育密切相关，钙磷比例是否平衡关系到幼犬正常生长发育过程。涉及血脂水平的机制尚未完全阐明，可能是因为益生菌可发酵难以消化的碳水化合物，分泌短链脂肪酸[11-12]，促进胆固醇从血浆中再分配至肝脏，从而降低血脂水平[13]。Baillon等[14]给健康犬连续灌喂28 dLactobacillusacidophilusDSM 13241，结果显示，犬的RBC数、RBC压积、HGB浓度均显著升高,犬免疫力得到了提高。Sun等[2]对1～2岁的比格犬灌喂WeissellacibariaJW15发现，比格犬血清TG和高密度脂蛋白水平会随Weissellacibaria灌喂量增加而显著降低；Cui等[6]在8周龄猪的玉米豆粕饲料中添加4.0×1011CFU/kg的枯草芽孢杆菌后发现枯草芽孢杆菌同样能显著降低血清TG水平， 与本试验中幼犬TG含量降低趋势一致， 表明微生态制剂可以提高比格幼犬血氧容量，并降低其血脂水平。Silva-Morita等[15]对20只小鼠灌喂50 g/kg果寡糖，发现小鼠血清TCHO显著下降。本试验比格犬血清TCHO水平差异不显著，可能是由于饲喂时间与动物物种等存在一定的差异性。

3.3 微生态制剂对比格幼犬血清免疫指标的影响

IL-1β为一种致炎细胞因子，由单核和巨噬细胞分泌，广泛参与动物机体组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程[16]。LPS是革兰氏阴性菌的内毒素，在肠壁完整时血液中的LPS含量较低，但是当肠黏膜出现损伤时，细菌会穿越肠黏膜进入血管，血清LPS水平上调[17]，通过检测血清IL-1β和LPS水平，可在一定程度上反映动物肠道损伤情况。本试验结果表明，微生态制剂组幼犬IL-1β和LPS水平与对照组相比无显著差异，说明微生态制剂对健康幼犬IL-1β和LPS水平影响较低。Yu等[18]对30只BALB/c小鼠灌喂165 mg/kg牛磺酸，发现小鼠血清LPS水平显著下降，但本研究中比格犬血清LPS水平无显著差异，可能与饲料剂量和物种存在关联。IgG是血清中免疫球蛋白的主成分，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫调节的功能[19]。IgA分为血清型IgA和分泌型IgA，其水平可反映机体免疫能力的强弱，它可以维持肠道稳态、调控肠道菌群等，对维持机体免疫系统的功能具有重要的意义[20]。在本试验中，微生态制剂组幼犬IgG和IgA水平与对照组相比无显著差异，说明微生态制剂对健康幼犬血清IgG和IgA水平影响较低。Rossi等[21]使用嗜热链球菌DSM 32245(StreptococcusthermophilusDSM 32245)、 双歧杆菌DSM 32246和嗜酸乳杆菌DSM 32241等益生菌混合制成的微生态制剂灌喂2～4岁的20只不同品种的健康犬，每日灌喂菌量4.0×1011CFU，结果显示，灌喂微生态制剂组的粪便中IgA和血清IgG水平显著增加，该报道与本试验结果不一致，可能是因为本试验中比格幼犬处于哺乳期，尚未进食商品化犬粮有关。相比于商品化犬粮，母乳中IgA和IgG含量较高[22-23]，影响了幼犬血清IgA和IgG水平。

3.4 微生态制剂对比格幼犬肠道菌群的影响

动物肠道内栖息着数量巨大且种类庞大的微生物群，肠道菌群不仅通过营养吸收影响宿主，而且通过微生物代谢物的下游效应在宿主体内发挥着重要作用[24]。肠道菌群对维护动物体胃肠道正常生理状态、提高胃肠道营养物质吸收起到不可替代的作用[25]，是动物体抵抗外界病原物质损伤的重要肠道屏障。在属水平上，Escherichia-Shigella多为条件致病菌，在一定条件下可以引起人和动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染[26]。链球菌属和梭菌属的种间差异较大，需结合种水平变化进一步分析。霍尔德曼氏菌属一般为肠道致病菌，可分解肠道黏液、增加肠道疼痛，同时提高其他细菌的感染风险，其含量偏低时有利于健康[27]。乳酸杆菌、片球菌为发酵糖类产乳酸的益生菌。 在种水平上，大肠杆菌和巴黎链球菌是动物肠道内条件致病菌，在一定条件下可以引起人和动物的疾病[28]。产气荚膜梭菌和犬大肠梭菌相对丰度显著增高，致使梭菌属相对丰度显著增高，产气荚膜梭菌广泛分布于环境、动物以及人的胃肠道中，是重要的条件致病菌[29]。Vagococcusteuberi首次分离于马里地区的发酵牛奶中[30]。贝莱斯芽孢杆菌首次分离自咸水湖中，尚未发现有致病现象[31]。屎肠球菌是人及动物肠道中正常菌群的一部分，具有抑菌作用[32]。本试验中，微生态制剂组比格幼犬粪便物种丰富度显著增加，结合门、属、种水平的物种构成发现，Escherichia-Shigella、霍尔德曼氏菌属等多数条件致病菌相对丰度显著降低，Vagococcusteuberi等产酸细菌相对丰度显著增高。提示该微生态制剂对比格幼犬肠道菌群结构起到了一定优化作用，说明该微生态制剂可以明显改善肠道菌群结构，有益于哺乳期比格幼犬肠道菌群的建立，维护肠道健康。动物双歧杆菌能够在体外抑制大肠杆菌和李斯特菌等病原菌的生长[33]，且能黏附在肠道黏膜抑制黏液中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等有害菌的含量。Rossi等[21]给试验犬灌喂嗜热链球菌DSM 32245、双歧杆菌DSM 32246、嗜酸乳杆菌DSM 32241混合制成的微生态制剂后，试验犬肠道菌群中乳酸杆菌、双歧杆菌相对丰度显著增加，产气荚膜梭菌相对丰度显著降低。 本试验中，微生态制剂组乳酸杆菌相对丰度显著增加，与上述报道结果一致，但微生态制剂组产气荚膜梭菌相对丰度显著提高，双歧杆菌显著降低，与上述报道结果不一致，其具体原理机制还待进一步探究。

4 结 论

复合微生态制剂可以促进幼龄比格幼犬体重增长，提高其血氧含量。菌群测序结果显示，复合微生态制剂可显著改变比格幼犬肠道菌群结构，提高肠道菌群物种相对丰度，优化肠道菌群组成，从而维护肠道健康，表明该犬用复合微生态制剂是一种安全、有益的犬用营养补充剂。