基于氮掺杂碳点快速检测环境水样及细胞内三价铁

王旭，何俊琦，孙慧君，徐向超，葛川*

（1.山西省科技情报与战略研究中心，山西 太原 030024；2.山西省气象灾害防御技术中心，山西 太原 030032）

0 引言

碳量子点（碳点，Carbon Dots，CDs），碳纳米家族中的新兴成员，自2004年由美国南卡罗来纳大学Xu等首次发现［1］和2006年美国克莱姆森大学的Sun等［2］首次命名以来，引起了研究者的广泛关注。碳点的粒径小于10 nm，是一种以碳为骨架结构的纳米材料。碳点表面富含羰基、羟基、羧基等官能团，使其具有优良的水溶性，而且很容易进行功能化。碳点还具有激发波长依赖性、发光效率高、光耐受性强、生物毒性低等优异的特性，进一步拓宽了碳点在纳米传感器、免疫分析、药物递送、光电装置、荧光探针、生物成像、光催化等领域的应用范围［3］。目前，关于碳点的制备方法主要分为两大类［3］：一是“自上而下法”，以大的碳源分子（如碳靶物等）为反应前体，通过电弧放电法［1］、激光消融法［2］或电化学氧化法［4］等，剥离得到碳点；二是“自下而上法”，是将小的碳源分子聚合碳化形成碳点，主要包括水热合成法［5-6］、微波法［7］、浓酸氧化法［8］、自放热碳化法［9-10］等。

三价铁（Fe3+）是环境中常见的金属元素之一，也是人体内必需微量元素之一，在各种生理过程如细胞形成和代谢、氧化反应、电子转移、组织呼吸、酶催化、DNA和RNA合成中起着重要的作用［11］。人体内Fe3+过量或不足均会导致疾病，如帕金森症、阿尔兹海默症、肾脏和肝脏损伤、贫血、智力下降、心力衰竭、糖尿病和癌症等［12］。因此，亟须构建一种选择性好、灵敏度高、抗干扰性能好的荧光传感器用于快速检测Fe3+。

关于碳点的制备，有很多工作基于生物质［13］开展，符合碳量子点“低成本”的制备原则。因此，本研究以废弃的柚子皮为碳源和氮掺杂剂，通过高温碳化法快速合成氮掺杂碳量子点（NCDs）。该方法原料来源广泛、制备方法简便、合成时间短、成本低，同时实现了废弃物的循环利用。Fe3+可强烈猝灭NCDs的荧光，基于此，构建了一种选择性好、灵敏度高、抗干扰性强的快速检测Fe3+的荧光传感器，并将该荧光传感器用于环境水样和细胞内Fe3+检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硫酸奎宁，实验中所用试剂氯化钙（Ca⁃Cl2）、氯化镁（MgCl2）、氯化铜（CuCl2）、氯化镍（NiCl2）、氯化钠（NaCl）、氯化铝（AlCl3）、氯化汞（HgCl2）、硝酸银（AgNO3）、氯化亚铁（Fe⁃Cl2）、氯化锰（MnCl2）、氯化钴（CoCl2）、氯化钡（BaCl2）、氯化锌（ZnCl2）、氯化钾（KCl）、三氯化铁（FeCl3）、氯化镉（CdCl2）、氯化铅（PbCl2）、三氯化铬（CrCl3）等均为分析纯试剂，购自阿拉丁化学试剂有限公司。

Cary Eclipse荧光分光光度计（美国瓦里安技术中国有限公司），Lambda 365紫外可见分光光度计（美国珀金埃尔默股份有限公司），SCI⁃ENTZ-18ND真空冷冻干燥机（宁波新芝冻干设备股份有限公司），Tensor II傅里叶变换红外光谱仪（德国布鲁克公司），AXIS ULTRA DLD型X射线光电子能谱仪（英国Kratos公司），Q50型热重分析仪（美国TA仪器公司）；JEM-2100透射电子显微镜（日本电子光学公司），电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司），me204e分析天平（上海闵胜科技有限公司），SunRise酶标仪（奥地利Tecan公司），LSM-880超分辨激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）。

1.2 NCDs的制备

称取2.0 g剪碎的新鲜柚子皮于坩锅中，将坩埚置于电热鼓风干燥箱中，200oC下碳化4 h后取出，冷却至室温。将坩埚中已碳化的柚子皮在研钵中研磨后，将固体倒入烧杯并加30 mL超纯水进行超声溶解，过滤得到棕黄色溶液，将其冷冻干燥后，得到NCDs浅黄色固体粉末。

1.3 荧光量子产率计算

以硫酸奎宁为标准物（荧光量子产率ΦS为54%），利用公式（1）计算NCDs的荧光量子产率：

其中，ΦX和ΦS分别为NCDs和硫酸奎宁的荧光量子产率，IX和IS分别为NCDs和硫酸奎宁在350 nm激发波长下的荧光积分面积，AX和AS分别为NCDs和硫酸奎宁在350 nm处的吸光度值，ηX和ηS分别为NCDs和硫酸奎宁溶液的折射率。

1.4 NCDs用于环境水样中Fe3+检测

实际样品取自中国山西省太原市实验室自来水和汾河水，采样后，用0.45 μm孔径的滤膜过滤实际样品后直接使用。通过荧光法测试实际样品中Fe3+的含量，进一步利用加标回收率测试Fe3+在实际样品中的回收率。

1.5 毒性测试

NCDs的细胞毒性利用CCK-8法测试。将人宫颈癌HeLa细胞接种于96孔板，每孔细胞数为1×104个，接种完成后，将96孔板置于37oC含5% CO2（体积分数）的培养箱中孵育24 h，使HeLa细胞完全贴壁。向孔中加入不同浓度的NCDs溶液（50 μg/mL，100 μg/mL，150 μg/mL，200 μg/mL，300 μg/mL，400 μg/mL，500 μg/mL），其中6个孔中加入培养基作为空白对照，继续在培养箱中孵育24 h。取出96孔板去除其中的培养基，每个孔分别加入100 μL CCK-8 溶液（10 μL CCK-8母液 +90 μL DMEM），继续在培养箱中孵育40 min，将96孔板置于酶标仪中，于450 nm处测试每个孔中的光学密度值OD，利用公式（2）计算细胞成活率：

其中，OD实验组/OD空白组分别为加入 CNDs和未加NCDs时，孔中细胞的光学密度值。同样的方法测试在NCDs中，人正常肝细胞LO2的成活率。

1.6 NCDs用于细胞内Fe3+检测

将人宫颈癌HeLa细胞接种于激光共聚焦专用培养皿中，细胞密度为105个/皿，于培养箱中孵育24 h。待细胞完全贴壁后，向其中加入50 μL 10 mg/mL NCDs溶液（培养液中NCDs的实际浓度为0.5 mg/mL），在培养箱中共孵育12 h，利用pH 7.4的DPBS溶液清洗3次，保留0.5 mL DPBS溶液于培养皿中，将其置于激光共聚焦显微镜下观察贴壁生长的HeLa细胞的形态及荧光。随后向培养皿中加入5 μL 10 mmol/L Fe3+溶液（培养皿中Fe3+的实际浓度为0.1 mmol/L），10 min后，继续在激光共聚焦显微镜下观察同一位置的HeLa细胞形态及荧光。同样的实验步骤观察LO2细胞的形态和荧光。

2 结果与讨论

2.1 NCDs的表征

图1（a）为NCDs代表性的透射电镜图，由图可知NCDs近似球形，具有良好的分散性，无团聚现象。图1（b）为NCDs的粒径分布图，NCDs的尺寸介于3.3 nm～5.8 nm之间，平均粒径为（4.18±0.3）nm。

图1 NCDs的透射电镜图（a）和NCDs的粒径分布图（b）Fig.1 （a）TEM image and（b）particle size distribution histogram of NCDs

表1为NCDs的元素分析结果，由表可知：NCDs主要由C、H、N、O四种元素组成，质量百分比分别为：44.68%、5.98%、9.42%、39.92%，通过计算得到NCD的经验式为：C22H36N4O15。进一步利用红外光谱（FTIR）研究了NCDs表面的官能团，见图2（a）。NCDs在3 417 cm-1为O-H的伸缩振动，在2 918 cm-1为C-H的振动峰［5，8，10］。NCDs 在1 729 cm-1和1 048 cm-1分别为C=O和C-OH的伸缩振动，在1 613 cm-1为CON-H的弯曲振 动，在1 386 cm-1为 CO-N酰胺峰［5，8，10，14］。结果表明，NCDs表面富含OH、COOH、CONH以及其他含氧官能团，使NCDs具有良好的水溶性。

表1 NCDs的元素分析结果：（a）元素含量和（b）相对原子数目和经验式Table 1 Elemental analysis of the as-fabricated NCDs：（a）elemental content and（b）relative number of atom of NCDs

为了进一步确定NCDs的组成结构和表面官能团，利用XPS对其进行详细研究。如图2（b）所示，NCDs的XPS总能谱图中含有三个特征峰，位于529.9、375.0和283.5 eV，分别对应O 1s、N 1s和 C 1s，说明 NCDs中含有 C、N、O三种元素。图2C为C 1s分谱图，284.96、286.33、287.87、292.87和 295.69 eV 分别对应C-N-C、C-OH、C=O、O=C-O 和 O=CN［5，8，10，14］。图 2（d）为 N 1s分谱图，400.02 和402.27 eV分别对应Pyrrolic N和Pyridinic N［5，10，14］。图 2（e）为 O1s 分 谱 图，531.21 和532.61 eV 分别对应 O=C-O 和 C=O［5，8，10，14］。XPS分析结果与元素分析和FTIR结果一致，进一步证实NCDs表面被含碳、氧、氮等元素的官能团功能化，说明NCDs具有很好的水溶性。在N2保护下，进一步利用TGA研究了NCDs的热稳定性，如图2（f）所示，当温度达到210oC时，柚子皮和NCDs均失重15.4%，为吸附水的重量；当温度升高到500oC时，柚子皮和NCDs分别失重44.3%和58.5%，说明柚子皮和NCDs完全碳化热解，失去了聚合气体，如CO2、CO、NO2和NO等；温度继续升高到940oC时，柚子皮和NCDs分别失重24.7%和8.0%，NCDs趋于水平，而柚子皮仍在下降，说明通过直接碳化法柚子皮已完全碳化为NCDs，且NCDs具有良好的热稳定性。

图2 （a）NCDs红外光谱图，NCDs的X射线光电子能谱图：（b）总能谱图、（c）C1s能谱图、（d）N1s能谱图、（e）O1s能谱图、（f）柚子皮和NCDs的热重分析图（所有百分比均为质量百分比）Fig.2 （a）FTIR spectrum of NCDs.（b）XPS survey scan，（c）C1s，（d）N1s，（e）O1s spectra of NCDs，（f）TGA curves of shaddock peel and NCDs（All percentages are mass percentages）

进一步利用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、荧光量子产率和荧光稳定性研究了NCDs的光谱特性。如图3（a）所示，黑色实线为NCDs的紫外可见吸收光谱图，NCDs在250 nm～300 nm处有明显的吸收带，在278 nm处的肩峰是由 C=O 发生 n → π*跃迁引起的［5，7-8，10］。图 3（a）中的红色和蓝色实线表示NCDs的最佳激发（λex）和发射（λem）光谱图，可见NCDs的λex和λem分别位于342 nm和464 nm，即NCDs可发出蓝色荧光，这与365 nm UV光照下NCDs所发出的光是一致的（图3a插图）。NCDs在不同激发波长（300 nm～440 nm）下的荧光发射光谱图见图3（b），由图可知，随着激发波长逐渐增大，NCDs的发射峰发生显著红移，说明NCDs具有明显的激发波长依赖性［5，7-8，10］。以硫酸奎宁为参比，计算得到NCDs的荧光量子产率约为8.6%。

如图3（c）所示，详细研究了离子强度对NCDs荧光稳定性的影响。随着NaCl浓度的增加，NCDs的荧光强度有所增强；在高浓度（0.5 mol/L）NaCl溶液中，NCDs的荧光未发生显著变化；在整个浓度范围内，NaCl溶液并未影响NCDs的光谱特征，即NCDs适用于富含生理盐的体液中。光照对NCDs荧光强度的影响见图3（d），75 W氙弧灯持续照射100 min后，NCDs的荧光强度未发生变化，可见，NCDs有很好的耐光性和抗光漂白性。另外，NCDs固体粉末可快速溶解于超纯水中，于室温保存6 m不会产生任何沉淀，不发生荧光猝灭现象，说明NCDs具有良好的水溶性和荧光稳定性。

2.2 Fe3+荧光传感器的构建及机理研究

详细研究了常见金属离子对NCDs荧光强度的影响。选择 Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+、Na+、Al3+、Hg2+、Ag+、Fe2+、Mn2+、Co2+、Ba2+、Zn2+、K+、Fe3+、Cd2+、Pb2+、Cr3+十八种金属离子，研究了它们对NCDs荧光强度的影响。如图4（a）所示，F0和F分别为加入金属离子前后NCDs的荧光强度，Cu2+、Ni2+、Fe2+、Co2+、Pb2+、Cr3+与NCDs共存时，对NCDs的荧光有影响，可能是这些金属离子与NCDs表面的羟基、羧基和氨基发生了非特异性的结合［15］，导致NCDs的荧光发生微弱猝灭。在所有被测试的金属离子中，Fe3+可强烈猝灭NCDs的荧光。进一步，NCDs检测Fe3+的抗干扰实验结果见图4（b），表明：在其他金属离子（0.7 mmol/L）存在的情况下，NCDs检测 Fe3+（0.7 mmol/L）时未受到任何干扰，说明NCDs用于检测Fe3+时具有良好的抗干扰性。

NCDs检测Fe3+的时间响应结果见图4（c），结果表明：不同浓度的 Fe3+（0.5 mmol/L和 1.0 mmol/L）加入 NCDs中 30 s后，NCDs-Fe3+混合体系的荧光强度即达到恒定值，之后6 min内NCDs-Fe3+混合体系的荧光强度保持不变，说明NCDs可快速响应并检测Fe3+。为了确定溶剂对NCDs检测Fe3+的影响，在超纯水和不同pH缓冲溶液（2.0～12.0）中，测试了NCDs的荧光变化以及相同浓度Fe3+（0.7 mmol/L）对NCDs荧光的猝灭程度，结果见图4（d）。由图可知，在pH=12.0的缓冲溶液中，NCDs的荧光被Fe3+猝灭的程度最强（86.7%）；在超纯水和pH近中性范围（6.0～8.0）内，Fe3+对NCDs的荧光猝灭率约为42.5%～58.8%；在其他pH范围内，Fe3+对NCDs荧光猝灭率介于13.4%～59.5%之间。尽管在pH为12.0时，Fe3+对NCDs的荧光猝灭最强，但是在pH=12.0时，NCDs荧光猝灭了近82%，说明pH为12.0时，Fe3+对NCDs的猝灭作用很小。另外，在碱性条件下，Fe3+极易与OH-形成沉淀，与NCDs之间的结合作用减弱，不适于检测Fe3+。最终，选择超纯水作为溶剂，在NCDs中滴定Fe3+，该传感器也仅适用于pH位于近中性范围内（pH 6.0～8.0和超纯水）的实际水样中Fe3+检测，不适用于强酸强碱性实际水样中Fe3+检测。

图4 （a）常见金属离子对NCDs荧光影响，（b）在其他金属离子存在时，Fe3+对NCDs荧光影响，（c）NCDs检测Fe3+时间响应结果，（d）超纯水和不同pH下，NCDs的荧光变化及Fe3+对NCDs荧光猝灭，（e）Fe3+浓度（0.0 mmol/L～14.8 mmol/L）对NCDs荧光影响，（f）NCDs荧光强度与Fe3+浓度（10 μmol/L～610 μmol/L）之间的Stern-VolmerFig.4 （a）Relative change in PL intensity of NCDs after reacting with different metal ions.（b）The relative change in PL inten⁃sity of NCDs after reacting with Fe3+when the presence of other metal ions.（c）The PL intensity of the NCDs-Fe3+system un⁃der different time.（d）Relative PL intensity of the NCDs and the NCDs-Fe3+system under UPW and different pH buffer solu⁃tion.（e）Fluorescence quenching in the presence of Fe3+ions（0.0-14.8 mmol/L）.（f）The Stern-Volmer plot of NCDs at var⁃ious concentrations of Fe3+（10-610 μmol/L）.UPW represents ultrapure water

如图4（e）所示，随着Fe3+浓度增加，NCDs的荧光逐渐减弱。NCDs荧光强度与Fe3+浓度的斯特恩-沃尔默（Stern-Volmer）图表见图4（f），其中 F0为空白 NCDs的荧光强度，F为NCDs与Fe3+共存时对应的荧光强度。猝灭效率由Stern-Volmer方程（3）拟合：

其中，KSV为Stern-Volmer猝灭系数，［Q］为Fe3+浓 度 。当 Fe3+浓 度 在 10 μmol/L～610 μmol/L时，F0/F与Fe3+浓度呈线性关系，通过计算得到KSV为1.9× 103L/mol，相关系数R2为0.9958。该Fe3+荧光传感器的最低检出限为68 nmol/L，低于饮用水中Fe3+的允许检出量。可见，NCDs可潜在用于水体中Fe3+的检测。表2比较了该工作与已发表的Fe3+荧光传感器，表明我们所构筑的Fe3+荧光传感器具有较低的检出限，与已发表的工作具有可比性［7，16］。

表2 基于不同碳点的荧光法检测Fe3+结果比较Table 2 Comparison of the proposed method with CDs employed for Fe3+determination.

图5（a）是Fe3+使NCDs荧光猝灭的机理示意图。一方面，Fe3+与NCDs表面的OH、COOH和C-N等官能团结合形成配合物附着在NCDs表面，使NCDs导带激发态的电子通过表面官能团转移给Fe3+，发生光电子转移，导致NCDs荧光猝灭［6，14-15］；另一方面，NCDs表面官能团的变化，与Fe3+结合后NCDs尺寸的变化，均可能导致NCDs的荧光发生猝灭。为了证明上述机理，测试了NCDs-Fe3+混合体系的TEM和 EDS 元素能谱，分别见图 5（b）和 5（c）。由图5（b）可知，NCDs-Fe3+混合体系的平均粒径为（4.55± 0.2）nm，大于NCDs的平均粒径（4.18± 0.3）nm，说明Fe3+与NCDs结合后，NCDs的尺寸稍有增加，证明NCDs与Fe3+之间有强烈的相互作用。进一步地，EDS元素能谱（图5c）中含有Fe3+，表明NCDs-Fe3+混合体系中存在Fe3+，且二者之间存在强烈的相互作用。

图5 （a）Fe3+猝灭NCDs荧光机理图，（b）NCDs-Fe3+混合体系的TEM图，（c）NCDs-Fe3+混合体系的EDS元素能谱图Fig.5 （a）Schematic diagram for the fluorescence of the NCDs quenched by Fe3+；（b）TEM image and（c）EDS element ener⁃gy spectrum of the NCDs-Fe3+mixed system

2.3 NCDs荧光传感器用于环境水样中Fe3+分析检测

为了考察所构筑Fe3+荧光传感器在实际样品分析检测中的应用价值，通过加标回收率实验测试了自来水和汾河水样中Fe3+含量。如表3所示，在自来水和汾河水样中Fe3+的加标回收率介于98.23%～104.75%之间，相对标准偏差小于0.47%。可见，该荧光传感器可潜在用于环境水样中Fe3+检测，具有较高的灵敏度和重现性。

表3 自来水和汾河水样中Fe3+的分析测定Table 3 Analysis and detection of Fe3+in tap water and Fenhe river.

2.4 NCDs荧光传感器用于细胞中Fe3+检测

利用CCK-8法研究了NCDs的细胞毒性，将不同浓度的NCDs分别加入HeLa和LO2细胞中，共孵育24 h后，通过酶标仪测试并计算细胞的成活率。如图6（a）所示，当NCDs的浓度为500 μg/mL时，HeLa和LO2细胞的成活率仍大于88%，说明NCDs具有较低的细胞毒性，能潜在作为一种试剂用于细胞成像。

图6 （a）NCDs对HeLa和LO2两种细胞的毒性，（b）HeLa和（c）LO2细胞在0.5 mg/mL NCDs（第1列）和0.5 mg/mL NCDs/1.0 mmol/L Fe3+（第2列）中的激光共聚焦成像图（i和v为明场图，ii和vi为405 nm激发暗场图，iii和vii为488 nm激发暗场图，iv为i、ii和iii叠加图，viii为v、vi和vii叠加图）Fig.6 （a）Effect of NCDs on HeLa and LO2 cells viability.Laser scanning confocal microscope images of（b）HeLa and（c）LO2 cells incubated with 0.5 mg/mL NCDs（first column）and 0.5 mg/mL NCDs/1.0 mmol/L Fe3+（second column）.i and v show the bright-field images of HeLa and LO2 cells.ii（vi）and iii（vii）are cell images taken at λex/λemof（405/422 ± 25）and（488/500± 25）nm，respectively.iv and viii are the merged images of i，ii and iii and v，vi and vii，respectively

通过外加法将NCDs荧光传感器用于体外细胞中Fe3+检测，以HeLa和LO2细胞为模型，经NCDs孵育后，加入Fe3+前后，通过激光共聚焦显微镜观察HeLa和LO2的形态和荧光。如图 6（b）和 6（c）所示，明场细胞（i和 v）形态良好，表明NCDs具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性；经405 nm和488 nm激光激发，HeLa和LO2细胞发出明亮的蓝色（ii）和绿色（iii）荧光；明场和暗场叠加图（iv和 viii）说明NCDs可穿透细胞膜进入细胞质和细胞核。加入 Fe3+后细胞内NCDs的蓝色（vi）和绿色（vii）荧光显著猝灭，可见该荧光传感器可潜在用于细胞内Fe3+检测，且具有普适性。

3 结论

以废弃的柚子皮为碳源和掺杂剂，通过高温碳化法一步合成氮掺杂碳量子点（NCDs）。制得的NCDs表面富含羟基、羧基、碳氮键以及其他含氧官能团，可与Fe3+发生光电子转移，同时NCDs表面官能团和尺寸发生变化，导致NCDs的荧光强烈猝灭，从而构筑了选择性高、灵敏性好及抗干扰性强的Fe3+荧光传感器。将该荧光传感器用于自来水和汾河水样中Fe3+检测，加标回收率为98.23%～104.75%，相对标准偏差小于0.47%，具有较高的灵敏度。另外，该荧光传感器可成功用于细胞内Fe3+检测。可见，该荧光传感器有望用于环境样品、生物样品和细胞中Fe3+的快速灵敏检测。