响应面优化流苏石斛多糖提取工艺

宋智琴，韩雪，杨平飞，刘海，罗鸣，吴明开

贵州省农业科学院作物品种资源研究所（贵阳 550006）

中药石斛始载于《神农本草经》，且被列为上品，具有益胃生津、滋阴清热等功效。流苏石斛（Dendrobium fimbriatum）又名马鞭石斛、大黄草、流苏棒等，是兰科石斛属植物，为多年生附生性草本植物，1977—2020年历版《中华人民共和国药典》收载石斛来源植物之一，是我国常用传统药材与中成药的原料，具有很高的药用价值。2020版《中国药典》收载于石斛项下，全年均可采收，具有益胃生津、滋阴清热的功效。用于热病津伤，干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸 劳热，目暗不明，筋骨痿软的治疗[1]。植物多糖是人体内的一种信息分子，广泛存在于自然界和生物体中，具有免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用，还能降血脂、延缓衰老、抗疲劳等作用[2-4]，而流苏石斛中富含多糖类、氨基酸类、苷类等多种化合物[5-10]。现代药理研究表明流苏石斛中多糖具有提高免疫、抗氧化、肝保护等作用[11-15]。

植物中多糖的提取技术有水提醇沉法、微波法、超声波法、超临界流体萃取法等。其中，超声波辅助水提法相对操作简单快速，提取效率高，工艺成本也相对低[16]。对流苏石斛的研究主要集中于组培快繁、成分结构和药理活性，而关于流苏石斛多糖的研究较少，试验以流苏石斛为原料，采用超声波辅助提取流苏石斛中的多糖，用苯酚-浓硫酸法测定其中多糖含量，利用单因素试验研究液料比、提取温度、提取时间对多糖制备的影响，在此基础上进一步通过响应面法分析各因素及其相互作用对多糖得率的影响，得到最优多糖制备工艺条件，以期为制备流苏石斛多糖的中试放大生产提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

流苏石斛（采自贵州省安龙县欣蔓生物技术有限公司“仙草谷”基地）。

1.2 主要仪器及试剂

RE100-Pro旋转蒸发仪[大龙兴创实验仪器（北京）有限公司]；DK98-ⅡA电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；HC-2518高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；BT125D分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；FW100粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHB-Ⅲ真空泵（天津市心雨仪器有限公司）；UV-1800PC型紫外可见分光光度计[翱艺仪器（上海）有限公司]；101-2AB型鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；KH-500TDB型超声波清洗器；试验用氯仿、无水乙醇、正丁醇等均为分析纯；浓硫酸为优级纯；D-无水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号110833-201506）；蒸馏水为实验室自制。

1.3 标准曲线的绘制

根据文献[17-18]的方法，精密称取10 mg干燥至恒重的无水葡萄糖溶于100 mL蒸馏水中，得0.1 mg/mL无水葡萄糖标准溶液。分别量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL标准溶液至试管中，加蒸馏水至总体积为2 mL，分别加入1 mL临配的5%苯酚溶液，摇匀，再加入5.0 mL浓硫酸，再次摇匀，置于沸水浴中10 min，冷却至常温，在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示，得回归方程y=30.71x-0.006 8，R2=0.998 5。

图1 葡萄糖标准曲线

1.4 多糖的提取及其含量测定

1.4.1 样品溶液的制备

将流苏石斛除去茎叶须根等杂质，洗净，于55 ℃烘干，用粉碎机粉碎后过0.425 mm（40目）筛，备用。

1.4.2 提取流程及吸光度测定

精密称取0.2 g流苏石斛，加入一定体积的蒸馏水在一定温度下超声提取一定时间，提取液定容至100 mL，即得样品溶液。取2 mL样品溶液至试管中，加入8 mL无水乙醇，摇匀，置冰箱内过夜，取出后以8 000 r/min离心20 min，弃上清液，定容至10 mL，用Sevage法除蛋白，取2 mL上清液，然后按照方法1.3测定吸光度，计算多糖得率。

1.5 提取工艺条件的优化

1.5.1 单因素试验

分别考察液料比、提取温度和提取时间3个因素对流苏石斛多糖得率的影响[19-20]。

1.5.2 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以液料比、提取温度和提取时间为因素，根据Box-Behnken设计原理，利用Box-Behnken组合设计试验方案优化提取工艺条件，并最终确定出最佳提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对多糖得率的影响

在室温条件下，超声提取15 min，确定液料比40∶1，50∶1，60∶1，70∶1和80∶1 mL/g对多糖得率的影响，结果如图2所示。

由图2所示，液料比对多糖得率的影响效果较为明显，在20∶1～40∶1 mL/g时，多糖得率随着液料比增加而减少，液料比50∶1 mL/g时，多糖得率先升至最高，之后又迅速下降，所以液料比50∶1 mL/g较佳。

图2 液料比对多糖得率的影响

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响

固定液料比50∶1 mL/g，提取温度为常温，考察超声提取时间10，20，30，40和50 min对多糖得率的影响，结果如图3所示：在10～40 min时，随着超声提取时间延长，其多糖得率增加，到50 min时多糖得率下降，因此选择提取时间40 min较佳。

图3 提取时间对多糖得率的影响

2.1.3 提取温度对多糖得率的影响

选取液料比50∶1 mL/g、超声提取时间15 min，考察提取温度40，50，60，70和80 ℃对多糖得率的影响，其结果如图4所示。

由图4可知，温度对多糖得率影响较大，40～60 ℃时多糖得率随温度升高而增加，温度60 ℃时多糖得率最高，此后有所下降。因此选取提取温度60 ℃较佳。

图4 提取温度对多糖得率的影响

2.2 响应面试验设计结果

2.2.1 响应面试验设计方案与结果

为进一步研究变量之间交互作用的影响关系，使用响应面分析法筛选最佳提取工艺。每个单因素的初步研究是响应面优化的指导范围，基于Box-Behnken设计原理，选择对多糖得率有影响的3个因素液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）进行三因素三水平响应面分析试验。响应面试验因素水平和结果见表1和表2。

表1 响应面试验因素水平和编码

表2 试验设计与结果

2.2.2 模型建立与方差分析结果

利用Design-Expert 10.0.1软件对试验数据进行分析，得到二次多项回归方程：多糖得率R（%）= 10.318+0.016 25A+0.188 75B+0.085C+0.115AB+0.257 5AC- 0.207 5BC-0.543 998A2-1.174B2-0.451 498C2。

对回归方程进行方差分析，如表3所示。其中，F值可用于检验各变量对响应值影响的显著性的高低。F越大，则相应变量的显著程度越高。工艺条件对多糖得率影响大小顺序为B＞C＞A，即提取时间＞提取温度＞液料比。模型的决定系数R2为0.987 0，说明模型具有较高显著性，而Radj2=0.970 3，能够解释试验97.03%的响应值变异，且与预测相关系数Rpred2也接近，说明此试验模型与真实数据拟合程度良好，具有实践指导意义，可用该模型分析和预测最优提取工艺。

表3 响应多糖得率拟合回归方程的方差分析结果

2.2.3 提取工艺各因素响应曲面分析

不同工艺条件对多糖得率的影响见图5～图7。从图5可以看出，液料比和提取时间的交互作用对多糖得率的影响呈抛物面分布，液料比一定时，随着提取时间增加，多糖得率先上升后下降，且波动幅度较大。同理，提取时间不变时，随着液料比提高，多糖得率也呈现先增加后减小，但是波动幅度小于提取时间的影响。在二者交互作用下，提取时间在交互作用中的贡献更大，对多糖得率影响也更大。仅考虑二者因素作用下的最优提取工艺组合范围：液料比45∶1～ 55∶1 mL/g，提取时间35～45 min。如图6所示，液料比和提取温度的变化均引起多糖得率先增后减波动。相较于图5，整体波动幅度相对较小，表明二者交互作用弱于液料比-提取时间交互作用。图形对称性较好，表明液料比和提取温度在交互作用中的贡献相当。取液料比50∶1 mL/g、提取温度60 ℃水平附近的值时，该组合作用下的多糖得率最高，实际工艺控制该条件对结果提取比较有利。由图7可以看出，交互曲面整体呈一近似拱形曲面，且曲面纵向跨度较大，表明二者交互作用显著。提取时间不变时，提取温度引起曲面小幅度变化，提取温度不变时，提取时间引起曲面大幅度变化，也就是说，在交互作用中提取时间的贡献率更大，实际工艺条件控制中应重点关注该敏感因子，设置合理工艺。提取时间在37～45 min水平范围内取值时，多糖得率较高，应控制该条件从而得到优化工艺参数。

图6 液料比-提取温度交互作用对多糖得率的影响（左）和等高线图（右）

为进一步准确确定全局最优解，以最大化多糖得率为优化目标，根据Design-Expert 10.0.1 软件运行结果，多因素共同影响下的最优综合工艺为液料比50.445∶1 mL/g、提取时间40.744 min、提取温度60.893 ℃，在此条件下模型预测的多糖得率为10.329%。根据响应面试验回归分析结果可得到等高线图及三维相应面图，如图5～图7所示。

图5 液料比-提取时间交互作用对多糖得率的影响（左）和等高线图（右）

图7 提取时间-提取温度交互作用对多糖得率的影响（左）和等高线图（右）

2.2.4 验证试验

考虑到实际操作，将各因子修正为液料比50∶1 mL/g、提取时间41 min、提取温度61 ℃，在此条件下进行3次平行试验验证，得到多糖得率10.19%、相对误差1.3%，验证结果与理论试验结果非常近似，表明该回归模型合理有效。

3 结论

试验采用超声波技术，通过单因素试验和响应面分析法优化流苏石斛的多糖提取工艺，得到二次回归方程R（%）=10.318+0.016 25A+0.188 75B+0.085C+ 0.115AB+0.257 5AC-0.207 5BC-0.543 998A2-1.174B2- 0.451 498C2。确定出的最优综合工艺为液料比50.445∶1 mL/g、提取时间40.744 min、提取温度60.893 ℃。各因素的显著水平为提取时间＞提取温度＞液料比。试验各因素的显著水平与巫兴东等[11]研究结果相同，在此条件下多糖得率理论值为10.329%，实际值为10.19%，二者误差在1.5%以内。因此采用响应面分析法建立模型优化得到的制备工艺参数准确可靠，可用于流苏石斛多糖提取的中试放大生产指导。石斛多糖是一种良好的活性物质，具有良好发展应用前景。