马尾松针提取物调控Nrf2-ARE通路治疗雄激素性脱发的研究

朱红柳,魏跃钢,闵仲生,高以红,羊剑秋

(1.南京中医药大学江阴附属医院,江苏 江阴 214400;2.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029)

雄激素性脱发(Androgenetic alopecia,AGA)是一种发生于青春期和青春期后的毛发进行性减少性疾病,也是临床最常见的脱发性疾病。据调查,全球约有60%～70%的人受到该病的影响[1]。在我国,男性AGA患病率为21.3%,女性为6.0%[2]。近年来,随着生活节奏的加快、饮食习惯的改变等,AGA的发病率呈现逐渐增多且年轻化的趋势。该病对患者的心理健康和生活质量有重要影响,目前经美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗AGA的药物非那雄胺和米诺地尔的有效率分别为48%和35%[1],且二者存在不同程度的不良反应。

研究发现,氧化应激可诱导毛囊提前进入退行期,抑制毛发生长并呈剂量依赖性地促进人毛囊角质形成细胞凋亡,参与AGA的病理发生[3-4]。松针提取物是指从松叶中提取的以黄酮类化合物为主的天然物质,具有抗氧化、抗炎、抗菌等多种生物学活性[5-6]。Kamimura等[7]研究发现原花青素作为一种天然抗氧化剂,能够呈剂量依赖性地抑制TGF-β1和TGF-β2诱导的毛囊上皮细胞凋亡,促进毛发生长。据此推测,同样具有较强抗氧化活性的松针提取物可能也具有促毛发生长的作用,但目前尚未见相关报道。马尾松针是分布最广、资源最多的一种松针。本实验拟通过建立双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT)诱导的AGA小鼠模型,观察马尾松针提取物促毛发生长的作用,探讨马尾松针提取物对抗氧化应激关键信号通路核因子E2相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)通路中相关蛋白表达的影响,为寻找新的治疗AGA药物提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

48只SPF级雄性C57BL/6小鼠,6～8周龄,18～22 g,由重庆医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证号:SYXK(渝)2018-0003。所有小鼠饲养于南京中医药大学实验动物中心,饲养温度(23±2)℃,湿度35%～60%,光照12 h。实验过程符合实验动物伦理道德的相关规定,实验伦理经南京中医药大学江阴附属医院伦理委员会审查通过，审查批件号:2018001。

1.2 药物与试剂

马尾松针由江阴市中医院提供。DHT(纯度≥98%,批号:ID0310)购自北京索莱宝科技有限公司，将1.2 g DHT粉末溶于橄榄油定容至20 mL配置成60 mg·mL-1混悬液。原花青素B2标准品(纯度≥98%,批号:MB7051)购自大连美仑生物技术有限公司，将原花青素B2粉末22.4 mg溶于224 μL乙醇溶液至完全溶解,加0.5% CMC溶液定容至22.4 mL配置成1 mg·mL-1混悬液。

总RNA提取试剂盒(批号:R1200)购自北京索莱宝科技有限公司;Dullbecco改良Eagle高糖培养基(DMEM)、胎牛血清(批号:c11885500CP、1438121)购自美国Gibco公司;胰蛋白酶、青霉素-链霉素液(×100)、活性氧(ROS)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、RIPA裂解液(批号:H120711、082119190922、S0033S、S0131S、P0013B)购自上海碧云天生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(批号:ISEQ00010)购自美国Millipore公司；ECL增强化学发光检测试剂盒(批号:WP20005)购自美国Thermo Fisher公司;二喹啉甲酸(BCA)法蛋白浓度试剂盒(批号:T9300A)购自日本TaKaRa公司；Nrf2抗体(货号:A0674)、醌氧化还原酶1(NQO1)抗体(货号:A0047)、血红素加氧酶1(HO-1)抗体(货号:A1346)、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)抗体(货号:A17061)、转化生长因子β1(TGF-β1)抗体(货号:A15103)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;HRP标记二抗(货号:A0208)购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 仪器

CytoFLEX型流式细胞检测仪(美国Beckman公司),ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司),ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 马尾松针提取物的制备

选取新鲜的马尾松针,参考文献[8],鼓风加热干燥至质量恒定(含水量<10%),粉碎后过80目筛,采用85%乙醇溶液萃取,按照松针∶溶剂=1∶10提取松针中的活性物质,提取液用旋转蒸发仪浓缩,终浓度为10 mg·mL-1,保存备用。使用时将马尾松针提取物分别溶入0.5%CMC,制备混悬液,调至所需浓度0.8、1.6、2.4 mg·mL-1。

2.2 AGA小鼠模型的建立

适应性饲养1周,采用1%戊巴比妥钠(每100 g小鼠体质量给予0.4 mL)麻醉成功后,用剃毛刀剃除小鼠背部毛发,面积约2 cm×3 cm,然后按说明书涂抹脱毛膏,去除残留的毛发,确认小鼠毛发属于休止期(皮肤呈粉色),然后每只给予脱毛区(2 cm×3 cm)分区皮下注射DHT 500 μL(相当于30 mg·d-1)。

2.3 实验动物分组及处理

根据前期预实验结果,将小鼠随机分为6组:空白组(皮下不注射DHT)、DHT组(仅皮下注射DHT)、原花青素组(皮下注射DHT+原花青素B2 5 mg·kg-1)、松针低剂量组(皮下注射DHT+马尾松针提取物4 mg·kg-1)、松针中剂量组(皮下注射DHT+马尾松针提取物8 mg·kg-1)、松针高剂量组(皮下注射DHT+马尾松针提取物12 mg·kg-1)，每组8只。小鼠每日灌胃给药100 μL,给药28 d。

2.4 AGA小鼠模型毛发生长评价

①分别在给药前(d0)以及给药后第7、14、21、28天(d7、d14、d21、d28)给小鼠拍照,记录毛发生长情况并评分:未生长,脱毛区皮肤呈肉色,为0分;脱毛区皮肤呈灰色,为1分;脱毛区皮肤呈黑色,为2分;脱毛区皮肤呈黑色并有少许毛发长出为3分。

②给药后d28,采用1%戊巴比妥钠(每100 g小鼠体质量给予0.4 mL)进行麻醉,取小鼠背部脱毛区皮肤,用20 mm打孔器于每只小鼠脱毛区相同位置取圆形皮片,手术刀刮除皮片上所有体毛,分析天平称质量,计算各组小鼠毛发质量均值。

③取圆形皮片进一步做常规石蜡切片,脱蜡复水,HE染色,光学显微镜下计算生长期、休止期毛囊数量及二者的比值。计算毛囊数量(0.09 mm2,×100)。

2.5 皮肤组织中ROS和MDA含量的检测

将取下的小鼠背部皮肤置于含双抗的PBS中浸洗30 s,取出剪碎,加胰酶消化液放入孵化箱消化1 h,随后研磨，取研磨液,用含血清的培养基终止消化,1 500 r·min-1离心5 min,用PBS重悬细胞洗涤2次,取上清液。采用流式细胞术检测ROS含量，MDA试剂盒测定MDA含量。

2.6 qPCR检测Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、TGF-β1 mRNA的表达

Trizol法抽提总RNA,qPCR分别检测各组小鼠背部皮肤组织样本中Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、TGF-β1 mRNA的表达。根据在线引物设计软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计上述基因引物,由重庆博艾迈迪森生物科技有限公司合成,具体序列见表1。以β-actin为内参基因,每组设3个复孔,实验重复3次。两步法qPCR扩增程序:95 ℃预变性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30～34 s,共40个循环。应用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primer

2.7 Western blot检测Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、TGF-β1蛋白的表达

将小鼠背部皮肤组织放入液氮冷却的研钵中冷冻并研碎,加入RIPA裂解液。4 ℃,13 000 r·min-1离心20 min,将离心后的上清分装到1.5 mL EP管中,-70 ℃保存。取蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按4∶1混合后于沸水中煮5 min使蛋白变性。加样孔中加入样品;80 V跑浓缩胶后转换电压至120 V,转PVDF膜。PVDF膜用5%脱脂奶粉溶液(溶于TBST)室温振荡封闭1 h。加入一抗(1∶1 000～1∶2 000),4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,每次10 min,加入二抗(1∶1 000),室温孵育1 h。最后将ECL曝光液按A液∶B液=1∶1混匀后均匀覆盖于PVDF膜,反应1 min放入曝光仪检测。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 各组毛发生长情况的比较

如图1所示,DHT组脱毛区在28 d内未见毛发长出,部分在d14后小片区域皮肤呈现灰色但不明显,显示DHT注射后AGA小鼠建模成功。松针各剂量组于d14起大部分背部皮肤呈现灰色,且部分出现片状黑色毛发,尤其是高剂量组最为显著。原花青素组也在d14开始见效,但起效时间较松针高剂量组晚。

图1 各组小鼠毛发生长情况的比较Fig.1 Comparison of hair growth in each group

如图2所示,除DHT组外,各组随着用药时间的延长,毛发生长情况评分值逐渐升高。空白组于d7达到1分,d14即达到3分,而原花青素组和松针各剂量组在d14均大于1分,d21开始均接近3分。

图2 各组小鼠背部毛发生长情况评分比较Fig.2 Comparison of hair growth scores in each group

如图3所示,与空白组比较,DHT组毛发质量显著降低(P<0.001)。松针组随着给药剂量的升高,毛发质量逐渐增长,与DHT组比较,差异均具有统计学意义(P<0.001)。

3.2 各组小鼠背部皮肤组织中生长期、休止期毛囊数量及其比值的比较

HE染色如图4所示,空白组的毛囊呈活跃增生状态,毛囊数较多,可以看到新生的毛囊及内毛根鞘,毛球内有明显的黑素形成。DHT组毛囊数明显减少,毛囊体积较小。与DHT组比较，松针低、中剂量组未见明显差异,但松针高剂量组毛囊密度明显增加,其镜下改变与空白组和原花青素组相似,可见较多的新生毛囊及内毛根鞘,毛球内有黑素形成,毛囊数较多,体积较大。

注:与空白组比较,***P<0.001;与DHT组比较,图3 各组小鼠背部毛发质量比较Fig.3 Comparison of hair weight in each group

图4 各组小鼠背部圆形皮片HE染色(×100)Fig.4 HE staining of the circle skin in each group (×100)

如表2所示，在生长期毛囊计数中,空白组计数最多,DHT组最低,2组间差异具有统计学意义(P<0.01)。松针高剂量组生长期毛囊计数与DHT组相比,具有显著性差异(P<0.01),与空白组和原花青素组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。在休止期毛囊计数中,各组间差异不明显,除了松针中、高剂量组与空白组之间有统计学差异(P<0.05),其余均未见统计学差异。在生长期与休止期毛囊计数比值中,DHT组比值最低,与空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)，松针高剂量组和原花青素组明显高于空白组(P<0.05,P<0.01)。

表2 各组小鼠背部皮肤毛囊数量比较

3.3 各组小鼠背部皮肤组织中ROS和MDA含量比较

如图5～6显示,与空白组比较,DHT组ROS、MDA含量显著升高(P<0.01);与DHT组比较,松针中、高剂量组ROS、MDA含量均显著降低(P<0.05，P<0.01)。

注:与空白组比较,**P<0.01;与DHT组比较,图5 流式细胞术检测各组小鼠背部皮肤组织中ROS含量Fig.5 Comparison of ROS content in each group by flow cytometry

注:与空白组比较,**P<0.01;与DHT组比较,图6 各组小鼠背部皮肤组织中MDA含量比较Fig.6 Comparison of MDA content in each group

3.4 各组小鼠皮肤组织中相关mRNA及蛋白表达的比较

qPCR结果如图7所示,与空白组相比,DHT组Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA表达显著降低(P<0.05，P<0.01),而Keap1和TGF-β1 mRNA表达显著升高(P<0.05)。松针组呈剂量依赖性地促进Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA表达,抑制Keap1和TGF-β1 mRNA表达,中、高剂量组与DHT组相比,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果如图8所示,与qPCR结果基本一致,松针高剂量组促进Nrf2、NQO1、HO-1蛋白的表达,抑制Keap1和TGF-β1蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。

注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与DHT组比较,图7 qPCR检测各组小鼠皮肤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1及TGF-β1 mRNA的表达Fig.7 Expressions of Nrf2, NQO1, HO-1, Keap1, TGF-β1 mRNA in each group by qPCR

注:与空白组比较,*P<0.05;与DHT组比较,图8 Western blot检测各组小鼠皮肤组织中Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1及TGF-β1蛋白表达Fig.8 Expressions of Nrf2, NQO1, HO-1, Keap1, TGF-β1 protein in each group by Western blot

4 讨论

毛发周期分生长期、退行期和休止期。C57BL/6小鼠是研究AGA常用的动物模型,其毛发呈周期性生长。该小鼠躯干皮肤的黑素细胞只存在于毛囊中,而且仅在生长期时合成黑素并传递给角质形成细胞,使皮肤变成黑色,而退行期皮肤变成灰色,休止期皮肤变为粉红色,因此可根据皮肤颜色大致判断毛发周期情况[9]。本研究结果显示,人工脱毛后的C57BL/6小鼠背部皮肤均呈现粉红色,说明毛发进入休止期。

DHT是导致AGA的重要分子,其由睾酮在毛乳头细胞中经Ⅱ型5α-还原酶作用下转变而成。DHT与雄激素受体结合后发挥生物学作用,可使毛发生长期缩短,生长期/休止期毛囊比例下降[10]。本实验结果显示，DHT组小鼠背部皮肤未见颜色改变和毛发长出,HE染色显示，生长期毛囊数量明显减少(P<0.01),生长期/休止期毛囊比例显著降低(P<0.05)。而马尾松针提取物各剂量组小鼠背部皮肤从d14起，基本由粉红色转变为灰色,且部分可见黑色毛发长出,d21开始可见明显黑色毛发长出。HE染色可观察到马尾松针高剂量组生长期毛囊数量较DHT组明显增多,生长期/休止期毛囊比例显著升高(P<0.01)，作用与原花青素组相似,提示马尾松针可诱导毛囊进入生长期,延长生长期时间,并推迟进入休止期。

ROS是氧化应激的关键启动因子[11]。研究表明,在正常毛囊的新陈代谢过程中线粒体会产生一定量的ROS以维持其信号通路正常运行[12]。但当ROS产生过多且超出机体抗氧化物的清除能力时,会造成氧化应激和细胞损伤,导致毛乳头细胞脂质过氧化,促进其凋亡,并抑制角质形成细胞增殖,从而诱导毛发进入退行期[3]。本研究结果显示,DHT组ROS含量显著升高(P<0.05)。而MDA作为脂质过氧化最重要的产物之一,同样在DHT组中表达量显著升高(P<0.01),说明DHT对细胞有明显的过氧化损伤,而马尾松针可降低AGA小鼠ROS和MDA的含量(P<0.05，P<0.01)。

Nrf2-ARE信号通路是细胞抗氧化应激的关键通路[13]。在无任何刺激的情况下,Nrf2与Keap1相结合,处于相对抑制状态,并被铆钉在胞浆中。当发生氧化应激时,Nrf2将与Keap1解除偶联并转移入核,与核内ARE结合,启动一系列Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因，如NQO1、HO-1等的表达。本研究结果显示,与空白组比较,DHT组Nrf2、NQO1、HO-1的表达显著下降(P<0.05，P<0.01),Keap1的表达升高(P<0.05),而松针高剂量组促进Nrf2、HO-1、NQO1表达,抑制Keap1的表达(P<0.05，P<0.01)。TGF-β是毛发生长的负调控因子,其中TGF-β1被认为是AGA发病的关键因素[10]。DHT组TGF-β1的表达高于空白组(P<0.05),与DHT组相比,松针高剂量组TGF-β1的表达显著降低(P<0.01)。

综上所述，马尾松针可能是通过激活Nrf2-ARE信号通路,改善氧化应激水平，发挥AGA的治疗作用，其具体机制仍需进一步的深入研究。