瑞马唑仑对老年大鼠海马B淋巴细胞瘤-2、一氧化氮合酶蛋白表达及神经元凋亡和认知功能的影响

赵 娟，陈金权

(1.西安国际医学中心医院麻醉手术中心，陕西 西安 710100；2.咸阳市第一人民医院麻醉科,陕西 咸阳 712000)

随着年龄的增加，老年人多伴随有认知功能障碍，其特征为认知功能逐渐下降，也伴随有各种神经系统的指标降低[1]。老年人的病理特征为老年斑，伴随有淀粉样蛋白沉积，特别是神经元凋亡可导致认知功能障碍，而且淀粉样蛋白是凋亡过程的诱导因素[2]。在颅内脑组织中，海马神经元是学习、记忆等高级神经活动的重要部位，认知功能障碍患者的海马组织可受到伤害，导致学习、记忆功能障碍[3]。海马结构内嗅区可通过穿通道与齿状回颗粒细胞形成突触联系，然后与CA1锥体细胞、CA3锥体细胞形成突触联系[4]。理想的镇静药物应具有不良反应发生率低、起效快、顺行性遗忘、停药后能迅速恢复、对呼吸循环抑制小等特点[5]。咪达唑仑为临床上比较常用的全身麻醉诱导及辅助性镇静药，但其在临床应用中容易出现代谢物残留，使麻醉苏醒期延长，对机体的认知功能有一定的负面影响[6-7]。瑞马唑仑为一种新型超短效苯二氮卓类药物，是在咪达唑仑结构上引入一个可以代谢的丙酸甲酯侧链的产物，其可降低神经元的兴奋性，还可作用于γ-氨基丁酸A型受体，引起机体活动减少，神经细胞膜氯离子通道开放频率增加，从而使神经元产生抑制作用[8]。本研究探讨瑞马唑仑对老年大鼠海马B淋巴细胞瘤-2(B-lymphoma-2，Bcl-2)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)蛋白表达及神经元凋亡和认知功能的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级3月龄雄性SD大鼠45只购自南京君科生物工程有限公司，饲养于本院实验动物中心(合格证号：20984211)，雌雄不限，体重200～220 g。所有大鼠于清洁动物实验室饲养，操作过程符合动物伦理要求，每笼4只大鼠，实验室温度20～28 ℃，相对湿度50%～60%，通风良好，环境安静，实验期间自由进食饮水，12 h黑暗与12 h照明交替。大鼠在实验前适应性驯养1周。本研究得到了实验动物伦理委员会的批准。瑞马唑仑(国药准字H20200006)购自人福药业，咪达唑仑(国药准字H10980025)购自恩华药业。通道式水迷宫由黑色有机玻璃制成(中国医学科学院药物所研制)。颅脑立体定位仪购自西北光学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 老年大鼠模型的建立：所有大鼠都给予腹腔注射D-半乳糖建立亚急性衰老模型，以0.9%氯化钠溶液配制1.25% D-半乳糖溶液，依照50 mg/(kg·d)的标准量对大鼠进行腹腔注射，连续注射6周。在造模完成后，对存活的大鼠进行水迷宫行为学检测，发现有行为学改变的大鼠39只，即建模成功。

1.2.2 大鼠分组与处理：将39只亚急性衰老大鼠随机平分为模型组、咪达唑仑组、瑞马唑仑组。咪达唑仑组、瑞马唑仑组分别经尾静脉持续输注咪达唑仑6 mg/kg、瑞马唑仑6 mg/kg，持续7 d，每天输注8 h。模型组用同样方法输注等剂量0.9%氯化钠溶液。

1.3 观察指标 ①Morris水迷宫实验：记录第1、3、7天大鼠逃避潜伏期时间，于第7天检测穿越平台次数，评估大鼠认知功能。②所有大鼠在处理第1、3、7天采集尾静脉血0.2 ml，不抗凝，静置30 min，3000 r/min高速离心10 min，取上清液检测超氧化物歧化酶(SOD)活性与丙二醛(MDA)含量。③各组大鼠恢复清醒后置于动物房，麻醉后处死，取海马组织制成病理切片，采用TUNEL法检测CA1与CA3区神经元凋亡指数。④取大鼠海马组织，在4 ℃研磨后加入蛋白裂解液提取总蛋白，定量蛋白浓度后进行Western blot实验，孵育的一抗包括抗Bcl-2抗体、抗NOS抗体(稀释度为1∶1000)，二抗稀释度为1∶5000，采用ECL进行显色，以β-actin为内参计算目的蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1 三组大鼠不同时间点Morris水迷宫实验结果比较 见表1。处理后第3、7天，咪达唑仑组和瑞马唑仑组逃避潜伏期高于模型组，且瑞马唑仑组低于咪达唑仑组(均P<0.05)；咪达唑仑组和瑞马唑仑组穿越平台次数低于模型组，且瑞马唑仑组高于咪达唑仑组(均P<0.05)。

表1 三组大鼠不同时间点Morris水迷宫实验结果比较

2.2 三组大鼠不同时间点血清SOD活性与MDA含量比较 见表2。处理后第3、7天，咪达唑仑组和瑞马唑仑组血清SOD活性高于模型组，MDA含量低于模型组(均P<0.05)；瑞马唑仑组血清SOD活性高于咪达唑仑组，MDA含量低于咪达唑仑组(均P<0.05)。

表2 三组大鼠不同时间点血清SOD活性与MDA含量比较

2.3 三组大鼠海马CA1区和CA3区神经元凋亡指数比较 见表3。处理后第7天，咪达唑仑组、瑞马唑仑组海马CA1区和CA3区神经元凋亡指数低于模型组，且瑞马唑仑组低于咪达唑仑组(均P<0.05)。

表3 三组大鼠海马CA1区和CA3区神经元凋亡指数比较(%)

2.4 三组大鼠海马Bcl-2、NOS蛋白相对表达水平比较 见表4。处理后第7天，咪达唑仑组和瑞马唑仑组海马Bcl-2、NOS蛋白相对表达水平高于模型组，且瑞马唑仑组高于咪达唑仑组(均P<0.05)。

表4 三组大鼠海马bcl-2、NOS蛋白相对表达水平比较

3 讨 论

随着年龄的增加，老年人多伴随有认知行为损害，可导致脑组织病理改变。腹腔注射D-半乳糖建立的亚急性衰老模型可使得外源性β-淀粉样蛋白出现局灶性坏死，引起神经元丢失与胶质增生，导致胆碱能神经功能减退[9]。同时，大鼠海马神经元损伤可伴随神经元数量减少、胶质细胞增生、炎症介质产生和免疫反应阳性细胞减少[10]。瑞马唑仑为一种水溶性超短效麻醉镇静药物，可抑制神经元的电活动，还可经非特异性血浆酯酶水解代谢。瑞马唑仑在临床上的应用具有对相关受体亲和力低、血流动力学平稳、起效快速等特点[11]。并且，瑞马唑仑代谢产物基本上无活性，经肾脏排泄，对相关受体亲和力低，因而对循环系统产生的影响较小[12]。本研究显示，处理后第3、7天咪达唑仑组和瑞马唑仑组逃避潜伏期均高于模型组，且瑞马唑仑组低于咪达唑仑组；咪达唑仑组和瑞马唑仑组穿越平台次数低于模型组，且瑞马唑仑组高于咪达唑仑组。提示瑞马唑仑、咪达唑仑都可降低大鼠认知功能，但与咪达唑仑相比，瑞马唑仑对老龄大鼠的认知功能影响较小。另外，处理后第3、7天，咪达唑仑组、瑞马唑仑组血清SOD活性高于模型组，MDA含量低于模型组；瑞马唑仑组血清SOD活性高于咪达唑仑组，MDA含量低于咪达唑仑组。从机制上分析，SOD为消除氧自由基的重要抗氧化酶，能通过歧化反应催化体内对人体有害的超氧化物转化为过氧化氢和氧气，清除代谢废物[13]；SOD活性降低可引起氧自由基不断堆积，导致脑神经元受到损伤。MDA可以反映机体内部脂质过氧化物堆积程度，也能反映体内自由基清除能力[14]。瑞马唑仑是在咪达唑仑的基础上研发的，具有更好的有效性和安全性，麻醉效果更好，且瑞马唑仑还可作用于γ-氨基丁酸受体来降低神经元兴奋，体内无蓄积且滞留时间短于咪达唑仑，能促使大鼠少动，从而发挥更好的镇静效应。瑞马唑仑可提高组织氧化酶活性，减少自由基损伤，抑制脂质过氧化反应，保护海马组织神经细胞[15]。

海马结构是大脑边缘系统的重要组成部分，老年大鼠多伴有氧化应激损伤，是触发神经元损伤的主要诱因，也是导致神经元凋亡增加的重要因素[16]。本研究显示，处理后第7天咪达唑仑组、瑞马唑仑组海马CA1区和CA3区神经元凋亡指数低于模型组，且瑞马唑仑组低于咪达唑仑组。从机制上分析，瑞马唑仑能快速作用于γ-氨基丁酸A型受体，使氯离子通道开放，氯离子内流，引起神经细胞膜发生超极化[17]。瑞马唑仑还能抑制促肾上腺皮质激素和皮质醇的表达，可通过抑制细胞因子分泌和调节细胞增殖来影响免疫细胞功能，从而抑制神经元电活动，也可抑制神经元凋亡[18]。

Bcl-2在各种损伤所致的神经元凋亡中发挥重要作用，主要分布于核膜、内质网膜、溶酶体膜、线粒体内膜上。Bcl-2具有消除自由基、抗氧化、抗衰老等作用，可抵御过氧化物对细胞膜的损害和干扰，对细胞膜的结构维持和功能保护具有一定的作用[19]。NOS是催化生成内源性一氧化氮的唯一酶类，在大鼠海马结构各区、各层均有分布，可能是参与学习记忆机制的关键酶，能促进机体的学习记忆[20]。而且，NOS能使机体对钙离子敏感性增加，导致突触前神经递质释放增加。本研究显示，处理后第7天咪达唑仑组、瑞马唑仑组海马Bcl-2、NOS蛋白相对表达水平高于模型组，且瑞马唑仑组高于咪达唑仑组，表明瑞马唑仑在老年大鼠的应用能促进海马Bcl-2、NOS蛋白表达，与文献[21]报道一致。从机制上分析，瑞马唑仑具有起效快、停药后能迅速恢复等特点，并且其不依赖肝肾代谢，消除了器官依赖性，从而有利于维护大鼠的海马神经元功能[22]。

综上所述，瑞马唑仑能促进老年大鼠海马Bcl-2、NOS蛋白表达，抑制神经元凋亡，对大鼠认知功能影响较小。