急性非洲猪瘟脑损伤及NF-κB介导脑水肿形成机制研究

罗 颖，张先东，李 慧，李樵锋，刘伟琪，付静静，黄璐琦，邓 桦，杨 鸿

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528231；2.中国中医科学院，北京 100700)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、烈性、出血性、高度接触性动物传染病，能影响所有品种和年龄的家猪或野猪，强毒株感染的致死率可达100%[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，在中国被列为一类疫病。非洲猪瘟的典型临床症状主要表现为高热、呕吐、腹泻、便血、皮肤发红、厌食和共济失调等[2-3]。针对此病，目前还没有商业化的治疗方法或有效的疫苗，自2018年中国报道首例非洲猪瘟之后，非洲猪瘟疫情迅速蔓延，给中国养殖业带来巨大经济损失[4]。

Karalyan等[5]研究发现，猪被ASFV基因Ⅱ型感染后会出现抽搐、运动障碍、共济失调等神经症状，剖检可见脑膜炎、硬膜下血肿及脑组织水肿。核因子κB(NF-κB)是一种具有广泛生物学功能且在信号传导通路中起枢纽作用的转录因子，广泛分布于淋巴细胞、神经元和星型胶质细胞中，被激活后能与多种细胞因子基因的结合位点特异性结合，调控其转录和表达[6]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)和干扰素-γ(interferon-gama，IFN-γ)具有NF-κB的结合位点，其中，TNF-α与IL-1β的高水平表达可诱导NF-κB的活化，活化的NF-κB对三者的转录进行调控，使其产生和释放增多，扩大炎症反应[7-8]。此外，NF-κB通路可激活基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)，降解细胞外基质成分，导致血管通透性增加及脑水肿[9]。水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP-4)是脑内最主要的一种调节水平衡的通道蛋白，可介导水分子的跨膜转运，与脑内水液平衡的维持、渗透压调节、脑水肿形成等生理、病理过程密切相关，NF-κB信号通路在AQP-4基因表达调控过程中起着重要作用[10-11]。

本研究拟在试验条件下研究ASFV Ⅱ型 Pig/HLJ/18 毒株引起的急性脑损伤，并通过检测炎性因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)、NF-κB、MMP-9和AQP-4的表达探讨NF-κB介导脑水肿的形成机制，以期为非洲猪瘟的防控和进一步的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及毒株

18头60日龄体重约20 kg的健康长白猪购自北京六马科技股份有限公司，检疫证号为1100365616。ASFV Ⅱ型毒株Pig/HLJ/18由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.2 主要试剂

兔抗人TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB p65、MMP-9和AQP-4单克隆抗体均购自Affinity Biosciences公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物工程有限公司；柠檬酸钠缓冲液购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 动物试验

18头长白猪随机分为2组，攻毒组(13头)和对照组(5头)。攻毒组经肌内注射接种剂量为102HAD50/mL(HAD50:半数红细胞吸附量)的ASFV毒株Pig/HLJ/18，对照组接种等体积生理盐水，自由采食和饮水。攻毒后第6天采集血清，灭活，实时荧光定量PCR方法检测血清ASFV核酸。试验期为15 d，试验期间，对死亡猪进行脑部剖检和脑组织取材，第15天将试验猪全部处死，剖检取材，放入中性福尔马林中固定保存。

参照邓桦等[12]方法在中国动物疫病预防控制中心动物生物安全三级实验室进行动物试验。

1.4 原位PCR检测

采用原位PCR技术对脑组织中ASFV VP73蛋白进行定位，根据ASFV VP73蛋白序列(GenBank 登录号：S89966)设计1对引物，引物序列为F：5′-ATGGCATCAGGAGGAGC-3′；R：5′-CTGGGGAATACCAAAGGT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

常规石蜡切片，脱蜡复水，蛋白酶K 37 ℃消化20 min，95 ℃孵育2 min后灭活蛋白酶，用洗液洗涤2次，每次5 min。按原位PCR试剂盒(Digoxin)说明书要求，对组织中DNA进行变性、杂交与扩增液的滴加，PCR仪中进行扩增。扩增结束后，浸入洗液中洗涤并用预冷的100%乙醇进行固定。最后将Anti-Digoxin-Cy3与1% BSA按1∶100比例稀释，滴加于标本上，37 ℃孵育1 h。PBS洗涤3次后滴加DAPI Antifade Solution，盖玻片封片，荧光显微镜下观察拍照。

1.5 脑组织病理学观察

对固定的脑组织进行修整，大小为1.5 cm×1.5 cm×2 cm，自来水冲洗、梯度酒精脱水、浸蜡、包埋，连续切片(5 μm)，HE染色、甲苯胺蓝染色后分析脑组织的病理变化。

1.6 脑组织中炎性因子、NF-κB、MMP-9及AQP-4的检测

通过免疫组织化学染色法对脑组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9及AQP-4进行检测。常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，用柠檬酸钠缓冲液煮沸修复，恢复室温后用0.3% H2O2封闭，将TNF-α抗体(1∶500)滴在切片上，于37 ℃孵育2 h。PBS冲洗后滴加二抗，孵育2 h后用PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，酒精梯度脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片。IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9和AQP-4分别按照以上步骤操作，抗体浓度分别为1∶100、1∶250、1∶500、1∶250和1∶500。每张切片选取6个视野，运用Image J 1.0图像分析软件测定各因子阳性细胞表达率。

1.7 数据处理

运用SPSS 22.0统计软件进行分析处理，两组间比较采用独立样本T检验，试验结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 临床症状与脑部剖检病变

攻毒后第6天攻毒组所有试验猪ASFV血清核酸检测均为阳性，说明非洲猪瘟病例复制成功。发病猪临床症状最初表现为体温升高、食欲减退、皮肤潮红，之后食欲废绝、目光呆滞、皮肤可见出血点、衄血或便血，至攻毒后第15天全部死亡，病死猪主要表现为血凝不良、溶血及尸僵不全。死亡猪各组织器官均出现不同程度的病变，包括水肿、出血、梗死和弥散性血管内凝血等，病理变化以血液循环障碍尤为突出。 试验期间攻毒组9头猪(9/13，69.23%)表现出抽搐、瘫痪、震颤等神经症状。攻毒后第6天攻毒组开始出现死亡，早期死亡猪脑部剖检可见脑膜可视血管数量增多、脑体积增大、脑膜略紧张(图1A)；中期死亡猪脑部剖检可见脑膜血管树枝状充血、脑沟变浅、脑回扁平(图1B)；晚期死亡猪剖检可见脑部苍白湿润、有散在点状出血灶(图1C)。脑部剖检病变在早中晚期较为一致，主要表现为脑膜充血和脑实质水肿。

2.2 原位PCR检测病毒定位

采用原位PCR技术对脑组织中ASFV VP73结构蛋白进行定位检测，细胞核用DAPI进行染色，呈蓝色；病毒用Cy3进行标记，呈红色(图2)。可见ASFV主要位于脑部微血管的细胞中。

①A～C,分别为试验早期、中期和晚期。②a，水肿；b，树枝状充血；c，点状出血①A-C,Early,middle and late stage of the trial respectively.②a，Edema；b，Dendritic hyperemia；c，Spot hemorrhage图1 脑部剖检病变Fig.1 Brain autopsy lesions

图2 ASFV原位PCR检测结果Fig.2 Results of in situ PCR detection of ASFV

2.3 脑部病理组织学观察

2.3.1 HE染色观察 病变早期主要为脑水肿，可见脑皮质区结构疏松、血管周围间隙增宽、神经元肿胀变圆、染色变淡；中后期死亡猪脑组织除了表现脑水肿的特征外，还观察到脑血管充血及大量微血栓形成；此外，攻毒组脑组织还可见血管周围淋巴细胞浸润，形成围管性血管套；胶质细胞增生聚集成团，位于血管旁形成胶质结节；多个小胶质细胞围绕病变的神经元周围形成卫星现象，以及坏死的神经元被增生的小胶质细胞或巨噬细胞吞噬形成的噬神经细胞现象(图3A～3C)。对照组神经元大小正常，结构清晰，排列整齐，未见异常形态细胞，神经元细胞轴突走向基本一致(图3D)。

2.3.2 甲苯胺蓝染色观察 甲苯胺蓝染色结果显示，攻毒组脑皮质区神经元尼氏小体溶解或消失、数量减少，与对照组相比，染色变淡(图4)。

①A～C，攻毒组；D，对照组。②a，血管间隙增宽；b，神经元肿胀；c，血栓；d，血管套；e，胶质结节①A-C，Challenge group；D，Control group.②a，Vascular gap widening；b，Swelling of neurons；c，Thrombus；d，Vascular sheath；e，Glial nodule图3 脑组织HE染色观察结果(400×)Fig.3 HE staining results of brain tissues (400×)

A,攻毒组；B，对照组A，Challenge group；B，Control group图4 脑组织甲苯胺蓝染色观察结果(400×)Fig.4 Results of toluidine blue staining in brain tissues (400×)

2.4 脑组织中炎性因子、NF-κB、MMP-9和AQP-4的表达

免疫组织化学染色结果显示，攻毒组炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ主要在神经元和浸润的炎症细胞的胞浆及胞膜上呈黄色或者棕褐色表达(图5A～5C)，NF-κB的棕褐色颗粒主要分布在神经细胞及胶质细胞的细胞浆和细胞核(图5D)，MMP-9的阳性细胞呈棕黄色，主要为神经细胞及血管内皮细胞，着色部位主要为细胞浆(图5E)，AQP-4主要在微血管周围的星形胶质细胞上表达，呈明显极性现象(图5F)。与攻毒组相比，对照组TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB和MMP-9仅见少量神经细胞浅黄色着色(图5A′～5E′)，而AQP-4主要表达于邻近毛细血管壁的星形胶质细胞足突上和脑室周围的室管膜细胞，沿细胞膜呈棕色条带状染色(图5F′)。

通过 ImageJ 软件对免疫组化切片进行统计分析，攻毒组脑组织上述6种蛋白的阳性表达率均极显著高于对照组(P<0.01)(图6)。

A～F，分别为攻毒组TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9和AQP-4免疫组化结果；A′～F′，分别为对照组TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9和AQP-4免疫组化结果A-F，Immunohistochemical results of TNF-α,IL-1β,IFN-γ,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in challenge group,respectively；A′-F′，Immunohistochemical results of TNF-α,IL-1β,IFN-γ,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in control group,respectively图5 脑组织中炎性因子、NF-κB、MMP-9和AQP-4的表达(400×)Fig.5 Expression of inflammatory factors,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in brain tissues (400×)

与对照组相比，**，差异极显著(P<0.01)Compared with control group,**，Extremely significant difference (P<0.01)图6 脑组织中炎性因子、NF-κB、MMP-9和AQP-4的阳性细胞表达率Fig.6 Positive cell expression rate of inflammatory factor,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in brain tissues

3 讨 论

本试验中猪被ASFV感染后表现非洲猪瘟典型临床症状，病死猪表现败血症典型特征，病理变化以出血性病变为主，血液循环障碍与炎症反应贯穿病程始终，也是引起感染猪死亡的主要原因。攻毒组临床表现有神经症状，脑部病变主要为脑实质水肿和脑膜血管充血出血，这与Karalyan等[5]对非洲猪瘟急性期脑的病理形态观察结果基本一致。病变可见神经细胞肿胀淡染，尼氏小体溶解消失，卫星现象与噬神经元现象，血管周围间隙增宽，多量微血栓形成，血管周围淋巴细胞浸润等，表明ASFV能造成脑血管与神经元的损伤。ASFVVP73基因编码的VP73蛋白是ASFV的主要抗原性结构蛋白，可作为标识物检测ASFV的存在[13]。原位PCR方法检测发现，病毒主要在血管内皮细胞及巨噬细胞中表达，在胶质细胞上也有少量分布，表明病毒可进入中枢神经系统，感染血管内皮细胞、巨噬细胞及胶质细胞。有报道显示，血管内皮细胞在该病的出血性发病机制中起着中心作用，病毒对血管内皮细胞的感染能导致内皮细胞紧密连接的丧失，引起脑水肿[14]。 本研究也发现病毒存在于脑血管内皮细胞中，提示ASFV感染内皮细胞与脑损伤的形成密切相关。

有研究表明，ASFV所致的多数损伤可归因于细胞因子介导的相互作用[15]。 脑组织中，炎性因子主要来源于被激活的小胶质细胞/巨噬细胞，TNF-α、IL-1β和IFN-γ属于重要的炎性因子，病理状态下的大量释放可导致血脑屏障通透性增加，引起脑水肿[16-17]。NF-κB是一种能调节多种炎症和免疫基因表达的诱导性转录调节因子，NF-κB信号通路被TNF-α和IL-1β激活后，胞质内的NF-κB复合物易位进入细胞核内，调节靶基因的转录与表达[6,18]。MMP-9是明胶酶的一种，正常状态下在脑组织中呈低水平表达，过度表达时，可降解脑血管内皮细胞基底膜的主要成分，使血脑屏障通透性增加，引发并加重脑水肿；AQP-4是脑内最重要的水通道蛋白，也是血脑屏障的重要组成，血脑屏障的破坏程度与AQP-4的表达上调密切相关，NF-κB可参与MMP-9和AQP-4表达水平的上调[19-20]。本试验免疫组化结果显示TNF-α、IL-1β、IFN-γ呈高表达，且与对照组相比呈显著性差异，而NF-κB、MMP-9与AQP-4的阳性细胞表达率较对照组极显著增高，该结果说明ASFV所致脑水肿的发生发展与TNF-α、IL-1β、IFN-γ的异常高表达及NF-κB、MMP-9与AQP-4的增加有关。ASFV感染脑部后，促使炎性因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的产生与释放增加，并激活NF-κB信号通路，活化的NF-κB调节MMP-9与AQP-4基因的转录与表达，促使MMP-9与AQP-4表达量的增加，从而破坏血脑屏障的完整性，促进脑水肿的发生发展。此外，活化的NF-κB还可通过诱导TNF-α、IL-1β的过度或持续表达启动炎性级联反应，造成持续或放大的炎症反应，加重脑水肿。

4 结 论

ASFV所致脑损伤为脑膜血管充血出血、脑实质水肿，组织学病变显示病毒性脑炎。ASFV感染脑部，促使炎性因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ大量释放，并通过激活NF-κB信号通路，上调AQP-4和MMP-9的表达，诱导炎性因子的过度表达，引发并加重脑水肿。