供体来源的细胞游离DNA在移植肾缺血再灌注损伤中的应用价值

陈若洋 李大伟 吴佳晋 瞿俊文 孙 楠 张 明 袁晓东

上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科，上海 200120

肾移植是目前终末期肾脏病最有效的治疗手段[1]。肾脏缺血再灌注损伤是肾移植临床上一个相对突出的问题，轻则造成移植后早期肾功能不全，重则导致术后移植物无功能[2]。有研究表明肾脏缺血再灌注损伤还是肾移植后远期肾功能减退、肾纤维化及慢性排斥的重要诱因[3-7]。移植肾穿刺病理是判定移植肾缺血再灌注损伤程度的金标准[8]，但是因其为有创性操作且不易反复进行，在移植术后早期的应用受到限制。因此，需一种无创性的方法，早期、安全、准确地评价移植肾的缺血再灌注损伤程度。

供体来源的细胞游离DNA（donor-derived cell-free DNA，dd-cfDNA）可以用于监测移植物的状态[9-10]，能够特异性地反映移植肾发生的细胞损伤，并且其增加的幅度与损伤的严重程度成正比，目前多用于检测肾移植术后排斥反应的发生[11]。

本研究将dd-cfDNA%应用在肾移植术后移植肾缺血再灌注方面，拟分析dd-cfDNA%在移植肾缺血再灌注后不同时间段的表达并进一步分析临床使用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入2020 年3 月1 日至5 月31 日于上海交通大学医学院附属仁济医院肾移植中心接受同种异体肾移植术的患者，其中男28 例，女12 例；年龄32～68 岁，平均（41.5±11.8）岁。

在移植手术前，所有患者均被告知并同意接受在手术后按照研究方案进行采血并检测dd-cfDNA%，并得到了伦理学支持和批准。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①供受者＞18 岁；②公民逝世后器官捐献的单肾移植；③初次移植；④签署知情同意书。

排除标准：①妊娠期妇女；②接受多器官或多次移植（包括器官、组织、细胞、输血等）；③恶性肿瘤；④感染（包括供体来源性及自身感染）；⑤移植肾功能延迟恢复及发生排斥反应。

1.3 治疗方案

所有患者均采用以下免疫抑制方案：抗人胸腺细胞免疫球蛋白或巴利昔单抗联合甲强龙进行免疫诱导，随后口服钙调磷酸酶抑制剂和吗替麦考酚酯类及泼尼松进行免疫维持治疗。

1.4 细胞游离DNA 的采集和检测

用dd-cfDNA%采血管（Streck，美国，218962）收集肾移植患者的外周血样本，用离心机以1600 g 离心10 min，从上清液中提取dd-cfDNA%，用循环核酸试剂盒进行检测（Qiagen，德国，OSR-M105），之后采用Bayes 方法对dd-cfDNA%水平进行了定量[12]。

1.5 肾功能的判定

用受试者血清肌酐来衡量肾功能。一次性普通血清管（贝登，南京，20192410083）收集患者血清，利用肌酐测定试剂盒（ECRE-2，美国，YZB/USA1823-2012），采用肌氨酸氧化酶终点法对受试者肌酐进行检测。

1.6 统计学方法

采用R 3.5.3 软件对所得数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，不符合正态分布的计量资料以中位数（M）和四分位数间距（IQR）表示，采用单因素重复测量方差分析比较受试者术后不同时间点的dd-cfDNA%含量和肌酐，使用Shapiro-Wilk 检验正态分布，若因变量的方差协方差矩阵不满足Mauchly’s 球形假设，则采用经Greenhouse-Geisser 方法校正后的单因素重复测量方差分析结果。如果整体差异有统计学意义，再通过Bonferroni Post Hoc 检验进行时间因素的两两比较。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入分析人群的移植肾功能恢复情况

纳入分析的40 例肾移植术后患者，术后肾功能恢复顺利（图1），无移植肾功能延迟恢复及排斥反应的发生。通过单因素重复测量方差分析方法，分析肌酐测量值在肾移植术后不同时间点的变化情况。经Shapiro-Wilk 检验，各组数据服从正态分布（P ＞0.05），由于数据不满足Mauchly’s 球形假设检验（P ＜0.01），采用Greenhouse-Geisser 方法校正结果。整体分析发现：肌酐测量值在3 个时间点的整体比较，差异有高度统计学意义（F=149.32，P ＜0.01）。进一步两两比较，组内任意2 个时间点的肌酐测量值比较，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）。术后第3 天的肌酐测量值比术后第1 天降低245.65 μmol/L（95%置信区间：172.70～318.60 μmol/L）；术后第7 天的肌酐测量值较术后第3 天进一步降低195.95 μmol/L（95%置信区间：153.02～238.88 μmol/L）。见图1。

2.2 dd-cfDNA%在移植肾缺血再灌注后不同时间段的表达情况

通过单因素重复测量方差分析方法，分析ddcfDNA%在移植肾缺血再灌注后不同时间点的表达情况。经Shapiro-Wilk 检验，各组数据服从正态分布（P ＞0.05），由于数据不满足Mauchly’s 球形假设检验（P ＜0.01），采用Greenhouse-Geisser 方法校正结果。整体分析发现：dd-cfDNA%在3 个时间点测量值的整体比较，差异有高度统计学意义（F=320.38，P ＜0.01）。进一步两两比较，组内任意2 个时间点的dd-cfDNA%浓度比较，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）。术后第3 天的dd-cfDNA%浓度比术后第1 天降低8.97%（95%置信区间：7.71%～10.24%）；术后第7 天的ddcfDNA%浓度较术后第3 天进一步降低1.63%（95%置信区间：1.32%～1.94%）。见图2。

3 讨论

根据文献报道，肾脏的缺血再灌注损伤会造成移植肾生理功能的损伤。例如，短期内表现为移植物功能延迟恢复、急性排斥反应的增加[13]，长期的影响则会造成移植肾纤维化，从而降低移植肾的存活率[3-4]。目前，对于肾脏缺血再灌注损伤的评估多集中于移植前，主要从以下几个方面考虑：供体临床资料的评估，供者年龄，供者获取前低血压、低血氧过程，有无心肺复苏史，冷热缺血时间，零点穿刺病理[14]。移植术前肾脏的生理病理学变化固然重要，但是，对于肾移植手术血流开放后再灌注造成的损伤也具有讨论意义[15]。移植肾在受者体内再灌注时，因为缺血再灌注本身是最强有力的固有免疫激活因素之一[16]，同时由于供受者基因背景的差异，往往会引起炎症细胞因子和趋化因子的合成释放介导肾脏缺血再灌注损伤后免疫反应，这样一个过程会使得移植肾缺血再灌注损伤的影响更大。但是，对于这样一个过程，目前仍没有合适的评价指标来进行评估。

细胞游离DNA 在器官移植领域通常应用于移植术后排斥反应的无创性诊断，在既往研究中，发现dd-cfDNA%浓度分数＜1%提示无急性排斥反应，＞1%提示可能发生急性排斥反应[11]。dd-cfDNA%也用于评估受者的免疫抑制状态，并根据此调整患者的免疫抑制剂的用法和用量，制订个体化的治疗方案[17-18]。

在本研究中，本课题组分析了dd-cfDNA%在肾移植术后移植肾缺血再灌注后不同时间点的表达，提出了dd-cfDNA%可以作为一个简单快速的指标来检测肾移植术后肾脏缺血再灌注损伤程度。在不同时间点，受者外周血中dd-cfDNA%含量的表达不同，而且随着时间的推移，dd-cfDNA%含量逐步下降，最终维持在稳定区间。

肾脏缺血再灌注损伤和移植肾植入后的免疫反应是肾移植术后1 周内造成移植肾损伤的最主要的病理生理过程。由于供受者双方基因差异，肾移植术后长期存在移植肾的免疫反应。本课题组观察到dd-cfDNA%在肾移植术后早期明显升高，可达到20%左右，而对于移植后功能稳定期的患者，dd-cfDNA%保持在较低水平，往往＜1%[19-20]。当移植肾发生急性排斥反应时，dd-cfDNA%会明显升高，但即使是严重的排斥反应，dd-cfDNA%升高幅度有限，在1%～3%之间[21-24]，远低于肾移植术后早期的dd-cfDNA%。同时，在动物实验中，通过肾脏缺血再灌注后的肾脏病理切片可以证明肾脏缺血再灌注损伤程度在复灌24 h 达到高峰，之后肾小管启动自我修复机制[6，25]。在1 周后急性肾小管损伤的特征消失，这与本课题组临床观察的dd-cfDNA%的变化趋势是类似的。

因此，本课题组认为肾脏缺血再灌注损伤是造成肾移植术后早期dd-cfDNA%明显升高的主要原因，且肾移植术后早期受者体内dd-cfDNA%与肾脏缺血再灌注损伤及修复之间存在关联性，值得深入研究。

综上所述，本研究纳入40 例肾移植术后早期的患者，通过分析受者外周血中dd-cfDNA%含量，得出在肾移植术后早期，dd-cfDNA%含量较高，并随着时间的推移逐步降低，在术后第7 天下降至基线水平。由此得出结论，dd-cfDNA%在肾移植术后移植肾缺血再灌注的不同时间段有差异性表达，对移植肾缺血再灌注损伤程度的评估具有一定价值。

本研究的局限与不足：本研究纳入的样本量较少，未纳入亲属供肾受者及术后发生移植肾功能延迟恢复和其他并发症的患者。后续会开展进一步的研究，来检测不同受者人群在术后不同阶段的dd-cfDNA%的表达。