HPLC法同时测定感冒疏风片中5个成分的含量

李奇，田静

(扬州市食品药品检验检测中心，江苏 扬州 225001)

感冒疏风片由麻黄、苦杏仁、桂枝、白芍(酒炙)、紫苏叶、防风、桔梗、独活、甘草、大枣、生姜、谷芽(炒)12味中药组成，具有辛温解表，宣肺和中之功效，用于风寒感冒，发热咳嗽，头疼怕冷，鼻流清涕，骨节酸痛，四肢疲倦。方中桂枝发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气；酒白芍养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳；防风祛风解表，胜湿止痛，止痉；甘草补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药[1]。感冒疏风片现行标准WS3-B-2251-96收载于《卫生部药品标准中药成方制剂(第11册)》，无含量测定项[2]。现有质量相关文献寥寥，且仅针对方中某一药味的1～2种成分开展定量分析，不利于该制剂整体质量的控制[3-5]。因此，为了更好地控制感冒疏风片的内在质量，本试验分别选取上述4味药材中5个相关活性成分进行含量测定，首次采用波长切换高效液相色谱法同时测定该制剂中肉桂酸、芍药苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷以及甘草酸的含量，为该制剂质量标准提高和其临床用药等效性提供数据支撑。

1 试验材料与仪器

1.1 仪器 WATERS e2695型高效液相色谱仪，包括2998 PDA检测器(美国Waters公司)；XS205DU十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司)；KH-400KD超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；HH-4数显电子恒温水浴锅(国华电器有限公司)。Milli-Q Reference超纯水仪(美国密理博)。

1.2 试剂与试药 对照品芍药苷(批号：110736-202044，纯度96.8%)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号：111523-201208，纯度96.4%)、甘草苷(批号：111610-201607，纯度96.4%)、肉桂酸(批号：110786-201604，纯度98.8%)、甘草酸铵(批号：110731-201720，纯度97.7%)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯(迪马公司)，其余试剂为分析醇(国药集团化学试剂有限公司)，水为纯化水，3批感冒疏风片(昆明中药厂有限公司)，批号：490133(S1)、400146(S2)、400566(S3)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×4.6 mm，4 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脱 ，梯度洗脱条件见表1；流速1.0 mL·min-1；柱温28 ℃；检测波长：240 nm(0～14 min，检测芍药苷;25～30 min,检测5-O-甲基维斯阿米醇苷)、275 nm(14～25 min，检测甘草苷；30～40 min，检测肉桂酸)、250 nm(40～70 min，检测甘草酸)；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱条件

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 取芍药苷对照品、甘草苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、肉桂酸对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含芍药苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸1 028、169.1、61.31、19.27、308.2 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取感冒疏风片样品20片，研细，混匀，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，水浴加热回流30 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备 按感冒疏风片处方比例，模拟制备工艺制成缺酒白芍、桂枝、防风、甘草的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法分别制成阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液及缺桂枝、酒白芍、防风、甘草的阴性样品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，结果见图1。芍药苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸与相邻色谱峰的分离度均不低于1.5，阴性样品如图谱显示其他成分对5个待测成分的测定均无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分别置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。各精密吸取10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析。以对照品质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归分析，结果见表2。可知各成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 取 “2.2.1”项下混合对照品溶液3 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果芍药苷、甘草苷、甘草酸、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸峰面积RSD(n=6)分别为0.68%、0.63%、0.45%、0.64%、0.63%，表明仪器具有良好的精密度。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：400566)，分别于室温下放置0、2、8、16、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芍药苷、甘草苷、甘草酸、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸峰面积RSD(n=5)分别为1.1%、1.2%、1.4%、1.4%、1.1%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

A.对照品;B.供试品;C.缺防风阴性样品;D.缺桂枝阴性样品;E.缺酒白芍阴性样品;F.缺甘草阴性样品 1.芍药苷;2.甘草苷;3.5-O-甲基维斯阿米醇苷;4.肉桂酸;5.甘草酸图1 专属性试验HPLC色谱图

2.3.5 重复性试验 取同一批感冒疏风片(批号：400566)样品细粉6份，每份取约2 g ，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量。结果芍药苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸的平均含量分别为5.977、0.558 8、0.279 2、0.107 7、1.187 mg·g-1，RSD分别为1.9%、1.1%、0.70%、1.9%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的感冒疏风片样品(S3，批号：400566)约1 g，共6份，精密称定，按100%水平精密加入混合对照品溶液(含芍药苷1.056 6 mg·mL-1、甘草苷0.105 7 mg·mL-1、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.061 3 mg·mL-1、肉桂酸0.021 8 mg·mL-1、甘草酸0.222 5 mg·mL-1)5 mL，再精密加入甲醇20 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各成分的平均加样回收率及RSD，结果芍药苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸的平均加样回收率(n=6)分别为101.0%(RSD=1.0%)、98.2%(RSD=1.8%)、101.8%(RSD=1.5%)、96.8%(RSD=1.5%)及100.2%(RSD=1.4%)，详见表3。

表3 感冒疏风片5个成分的加样回收率试验结果(n=6)

表3(续)

2.4 样品测定 取3批感冒疏风片样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，按外标法计算样品中芍药苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸的含量，结果见表4。

表4 样品中5种成分的含量测定结果(mg·g-1)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本试验采用DAD检测器对5个目标化合物在190～400 nm波长处扫描，结果芍药苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸分别在232、275、232、277、252 nm波长处有最大吸收。为了保证各成分均有合适的灵敏度、分离度，并综合考虑成分的含量以及杂质干扰因素，最终选择波长切换模式。

3.2 色谱条件的优化 在选择流动相体系时，参考相关文献[6-10]，摒弃了甲醇体系，考察了乙腈-0.05%磷酸和乙腈-0.1%磷酸系统，结果在乙腈-0.05%磷酸体系下，芍药苷、甘草苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷化合物峰形略拖尾，且乙腈-0.1%磷酸系统分离度更高，故选择乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱。

3.3 供试品制备的优化 本试验考察了不同提取方式(加热回流、超声提取)、不同提取溶剂(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、不同提取时间(15、30、60 min)，试验结果表明，加热回流优于超声提取；以甲醇作为提取溶剂时各目标成分提取量最高；回流提取30 min时，各成分已基本提取完全。最终确定“2.2.2”项供试品溶液制备方法。

3.4 小结 本试验建立了采用高效液相色谱法同时测定感冒疏风片中5个指标成分含量的分析方法，涵盖了处方中君臣佐使中的4个药味，较全面地反映了该制剂的质量，该方法简单、可靠、效率高、专属性好，可为感冒疏风片质量标准的提高提供依据。