橙皮苷改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用机制研究*

范慧婕，赖逸贵，蒋雪峰，王强，李孔正，傅应昌，张为

1.阳江市人民医院，广东 阳江 529500； 2.南方医科大学，广东 广州 510515

《中国心血管病报告 2018》和《中国心血管健康与疾病报告2020概要》指出，我国心血管病死亡率位居首位，占全民死亡率40%以上，给我国经济带来沉重负担，防治心血管疾病刻不容缓[1-2]。动脉粥样硬化(atherosclerotic，AS)是诱发心血管疾病的主要病理生理基础，有效控制AS的发生发展是降低心血管意外发生的关键所在[3]。

AS是一种由于脂质代谢紊乱和免疫失衡引起的慢性炎症疾病。炎症学说是AS最早的发病机制之一，在AS斑块尚未形成的前期，炎症状态就已经出现[4]。研究认为，与AS发生发展关系较为密切的炎症细胞是巨噬细胞，巨噬细胞受到不同刺激时可极化成不同的亚型，而不同的亚型发挥不同的生物学作用，介导AS的发展进程[5]。巨噬细胞分为M1和M2两种，其极化失衡可影响AS的发展进程[6]。巨噬细胞具有可塑性，其极化指的是巨噬细胞在体内外微环境影响下表现出的极端异质性，M1 型巨噬细胞又称为经典激活的巨噬细胞，可由脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)及干扰素等炎症因子刺激而成，主要有促炎作用；M2型巨噬细胞又称为替代激活的巨噬细胞，可由白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等细胞因子刺激而成，具有抗感染作用[7]。目前，巨噬细胞极化亦是防治AS药物研究的侧重点，调控巨噬细胞极化是防治AS的有效策略之一[8]。

橙皮苷又名陈皮苷、橘皮苷，广泛存在于陈皮、枳实等中药中。研究表明，橙皮苷具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、抗炎等药理作用[9-12]，但橙皮苷对AS中巨噬细胞极化的作用机制未有深入报道。本研究主要探讨橙皮苷对巨噬细胞的作用。

1 材料

1.1 动物与细胞雄性ApoE-/-小鼠购买自广东省医学实验动物中心，5周龄，60只，体质量 20～22 g；Raw 264.7巨噬细胞购买自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物与试剂橙皮苷(成都曼思特生物科技有限公司，货号：A0032)；辛伐他汀(美国默沙东公司，批号：18032502)；LPS(上海源叶生物科技有限公司，货号：S11060)；胎牛血清、RPMI 1640培养液、青链霉素溶液、体积分数0.25%含有EDTA的胰酶(美国Thermo Fisher生物科技有限公司，货号：10100147、A4192301、10378016、2520072)；三酰甘油(triglycerides，TG)、总胆固醇(cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、重组人精氨酸酶1(arginase-1，ARG1) 、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1、J052-1、H321-1、H009-1、H007-1-1)；P-AMPK，AMPK，PPAR-γ，P-P65，P65，GAPDH(美国CST公司，货号：4186S、12063S、2435T、3039S、8242T、5174T)。

1.3 仪器CO2培养箱(美国Thermo公司，型号：3111)；离心机(湖南湘仪离心机有限公司，型号：TG16WS)；电泳仪(美国Bio-Rad公司，型号：powerpac HC)；酶标仪(美国MP公司，型号：ID5)。

2 方法

2.1 动物分组及给药将雄性ApoE-/-小鼠适应性饲养1周后随机分6组，即空白组、模型组、阳性对照组、橙皮苷低剂量组、橙皮苷中剂量组、橙皮苷高剂量组，每组10只。空白组用普通饲料喂养，其余组用高脂饲料(21%脂肪，0.5%胆固醇)喂养16周复制AS模型；阳性对照组于第9周开始在高脂饲料基础上给予辛伐他汀(5 mg·kg-1)灌胃；橙皮苷组于第9周开始在高脂饲料基础上给予橙皮苷低剂量(100 mg·kg-1)、中剂量(200 mg·kg-1)、高剂量(400 mg·kg-1)灌胃。

2.2 观察指标

2.2.1 血脂检测末次给药24 h后，各组小鼠眼球采血，收集血清，按照试剂盒说明书操作检测各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

2.2.2 小鼠主动脉根部油红O染色小鼠处死后制备主动脉根部的冰冻切片(厚度10～15 μm)浸泡于甲醇-钙固定液中固定。固定后的切片经水洗，放于体积分数60%异丙醇中，再置于油红O染色液中染色10 min。于体积分数60%异丙醇溶液中稍分化，水洗。置于明矾苏木素液中复染细胞核30～60 s，流水冲洗稍风干，甘油明胶封固，显微镜下观察各组小鼠主动脉血管壁脂质沉积情况，用Image J软件分析小鼠主动脉瓣斑块面积。

2.2.3 小鼠血清TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10检测采用ELISA法检测小鼠血清进行TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10水平。

2.3 分子对接从RCSB PDB数据库 (RCSB PDB，https：//www.rcsb.org) 下载AMPK的晶体结构，使用PyMOL软件(2.1.0版本)分离原配体和靶蛋白，用ADT对靶蛋白进行去水、加氢等处理；从PubChem数据库 (Pubchem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载橙皮苷SDF构象，用ADT进行加氢、计算电荷等处理，运用Autodock对接功能，计算受体和配体不同构象的最低结合能，并对不同构象的最低结合能进行排序，运用PyMOL分析和观察活性化合物与靶蛋白的对接结果。

2.4 细胞培养将Raw 264.7细胞以每孔3×105接种于12孔细胞培养板中，模型组加入含 100 pg·L-1LPS的RPMI 1640培养液，空白组加普通RPMI 1640培养液，37 ℃、5%CO2条件下培养48 h。橙皮苷组在模型组基础上加入橙皮苷：橙皮苷低、中、高浓度组分别给予橙皮苷 5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1。

2.5 Western Blot法检测细胞相关蛋白表达细胞分组和培养方法同上，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，然后进行蛋白变性，配胶(4%浓缩胶，10%分离胶)、上样(每孔上样量为15 μg)、电泳、转膜、封闭、孵育一抗、二抗，最后曝光，以GAPDH为内参，用Image J软件对蛋白条带的灰度值进行分析。

3 结果

3.1 各组小鼠TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比较模型组小鼠血清TG、TC、LDL-C水平高于空白组，HDL-C水平低于空白组，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示模型建立成功。与模型组比较，橙皮苷中剂量组、高剂量组及阳性对照组小鼠血清TG、TC和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠血清中TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比较

3.2 各组小鼠主动脉斑块比较与空白组比较，模型组小鼠主动脉瓣血管中发现大量的脂质积累，胶原纤维含量减少，斑块趋于不稳定；与模型组比较，橙皮苷高剂量组和阳性对照组能抑制小鼠血管中脂质的累积，显著减少主动脉内膜增厚，显著减少脂质区域，但阳性对照组优于橙皮苷高剂量组。见图1。与模型组比较，空白组、阳性对照组及橙皮苷高剂量组油红O染色斑块面积减小，见图2。

图1 各组小鼠主动脉斑块形成(比例尺：500 μm)

注：与模型组比较，**P<0.01

3.3 各组小鼠TNF-α、 IL-6、Arg-1、IL-10水平比较与模型组比较，空白组、橙皮苷低剂量组、橙皮苷中剂量组、橙皮苷高剂量组TNF-α、 IL-6水平降低，Arg-1、IL-10水平升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图3。

注：A：血清TNF-α含量；B：血清IL-6含量；C：Arg-1含量；D：血清IL-10含量；与模型组比较，**P<0.01

3.4 橙皮苷与AMPK的结合能力的预测使用分子对接程序 AutoDock vina 对橙皮苷与AMPK的结合能力预测，结果提示橙皮苷可以与AMPK的 ILE-46、GLN-109、ASN-111、ASN-110 等残基形成氢键而结合，结合力为-10.158 kcal·mol-1，表明橙皮苷与AMPK有较好的结合能力。橙皮苷与AMPK结合构象见图4。

注：A.橙皮苷与AMPK结合的外部示意图；B.橙皮苷与AMPK残基结合的示意图

3.5 橙皮苷对AMPK信号通路相关蛋白表达的影响橙皮苷使LPS诱导的Raw 264.7巨噬细胞p-AMPK、PPAR-γ蛋白表达显著上调，p-P65/P65水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图5。

注：A：Raw 264.7细胞的P-AMPK，AMPK，PPAR-γ，P-P65，P65，GAPDH的蛋白表达条带；B：Raw 264.7细胞的p-AMPK，AMPK，PPAR-γ，P-P65，P65，GAPDH的蛋白表达相对值；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

心血管急性事件一直是心血管疾病防治的重点与难点，AS是其重要的病理生理基础，也是其发病的重要原因之一。研究表明，AS的斑块脂质及其氧化衍生物的暴露可刺激巨噬细胞极化，M1型巨噬细胞极化促进AS的发生发展，而M2性巨噬细胞极化可有效保护AS的发生发展[8]。因此，寻找调控巨噬细胞M2极化的药物是目前研究抗AS的热点之一，而中药是这方面药物的重要来源。既往研究报道，丹参酮IIA、红景天苷、人参皂苷Rb1等可通过调控巨噬细胞极化防止AS斑块的形成[13-15]，巨噬细胞极化是防治AS药物的研究热点。研究指出，橙皮苷可有效抑制AS斑块的形成[12]，调节多种心血管危险因素包括血脂异常、血糖异常、血压异常等[11]，但其对AS巨噬细胞极化的调控作用尚未见有报道。

LPS是研究AS巨噬细胞极化细胞模型的常用诱导剂，可代表AS发生发展过程的慢性炎症改变，ox-LDL常用于造模模拟体内高脂环境[16]。本研究中小鼠造模时长16周，周期较长，主要研究小鼠在高脂影响下的血管慢性炎症性改变，从而导致主动脉斑块的形成，故相应的细胞实验采用的是LPS刺激巨噬细胞的体外模型模拟体内实验的炎症变化。

本实验采用高脂饲料喂养构建ApoE-/-小鼠AS体内模型和LPS诱导的Raw 264.7巨噬细胞极化构建体外模型，通过血清学、病理学、分子对接和Western Blot等方法，发现橙皮苷可有效改善高脂饮食诱导的小鼠AS斑块形成，降低血脂水平，减少M1巨噬细胞极化细胞因子TNF-α、 IL-6释放，上调M2巨噬细胞极化细胞因子Arg-1、IL-10 水平，降低P-P65的表达，上调P-AMPK/PPAR-γ的表达。

核因子-κB P65(nuclear factor-κB)是一个重要的转录因子，参与调控AS炎症反应相关的细胞因子、黏附分子表达。NF-κB P65信号通路的活化贯穿于AS血管内皮损伤到斑块形成的各个环节[17]。此外，P65可促进巨噬细胞M1极化，增加TNF-α、IL-6的释放[18]。AMPK即腺苷酸活化蛋白激酶，是一种细胞能量感受器，是调节机体合成代谢和分解代谢的主要蛋白激酶，影响蛋白质、脂肪、糖类的代谢途径，容易受到缺血缺氧、氧化损伤等病理因素的影响，对心血管起到保护作用[19-20]。PPAR-γ即过氧化物酶体增殖物激活受体，是AMPK下游调控糖脂代谢和炎症的重要转录因子，研究发现，PPAR-γ可调控脂质代谢，巨噬细胞逆转运胆固醇、抗炎及保护血管内皮细胞等作用[19-21]。AMPK的活化可以上调 PPAR-γ 的表达。此外，研究报道激活AMPK/PPAR-γ 可促进M2巨噬细胞极化，发挥抗AS的炎症作用，同时可通过抑制NF-κB(P65)活化，抑制M1巨噬细胞极化，从而发挥保护AS的作用[22]。

综上所述，橙皮苷可能通过激活AMPK/PPAR-γ通路，抑制NF-κB(P65)活化，调节巨噬细胞极化，抑制M1极化细胞因子的释放，促进M2极化细胞因子表达，抑制高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠AS发生发展。本研究结果发掘了AS治疗的新靶点，阐明橙皮苷防治AS的内在机制，为AS的治疗和后续研究确定新的靶点和思路，但其对AS巨噬细胞极化的具体调控机制仍需进一步探讨。