香丹注射液中吐温80的含量测定

巩晓宇 严俊珍 邱凤邹 陈秋燕 陆燕萍

深圳市龙岗区人民医院&香港中文大学(深圳)附属第二医院，广东 深圳 518172

香丹注射液为心脑血管类疾病的临床常用制剂，有扩张血管，增进冠状动脉血流量的作用，主要适用于冠心病、心绞痛，亦可用于心肌梗塞等。香丹注射液的主要成分有丹参、降香，辅料为吐温80(聚山梨酯80)。

吐温80在中药注射剂中一般作为助溶剂，能显著增加香丹注射液处方中植物提取物有效成分的溶解度，防止溶液浑浊而影响药物的吸收和释放。有报道显示，中药注射剂的不良反应事件与吐温80的含量有一定的相关性[1-2]，香丹注射液应用过程中比较常见的不良反应，一方面是消化道的症状，如恶心、呕吐等；一方面是过敏样反应，如皮肤发红、发痒、头晕等。这类症状与吐温80之间存在一定的关联性，建立吐温80的含量测定方法，对于指导临床用药、进行不良反应监控有十分重要的意义[3]。由于吐温80属于大分子的聚合物，而且紫外吸收较弱，很难通过常规的C18色谱柱分离检测，本试验采用高效液相法、凝胶色谱柱并结合蒸发光散射检测器对香丹注射液中的吐温80进行了含量测定和方法学研究，对多批次的香丹注射液样品进行分析考察，结果证实建立的方法可有效用于香丹注射液的安全性评价和质量分析。

1 仪器与试药

Agilent1200 高效液相色谱仪(德国)；凝胶色谱柱(TSK gel G2000SWXL 8.7 mm×30.0 cm)；Alltech 2000ES蒸发光散射检测器，LC-solution分析软件；梅特勒AB204-N型电子分析天平。

吐温80对照品(湖南和众三立科技发展有限公司，批号R03DX0)，香丹注射液(广东新峰药业有限公司，批号160602、160703、160903)。

甲醇、乙腈等为色谱纯，纯化水，醋酸铵(上海化工厂，批号130514)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取吐温80对照品适量，加流动相0.02 mol/L醋酸铵溶液-乙腈(90∶10)定量稀释制成每mL含5.0 mg的溶液(实际配制浓度：5.05 mg/mL)，作为对照品母液。再精密量取5 mL，用流动相定容至25 mL容量瓶中，得到浓度为1.01 mg/mL的对照品溶液。

2.2 样品溶液的制备 取香丹注射液，摇匀，用注射器吸取5 mL，用0.45 um微孔滤膜过滤，取续滤液2 mL置样品瓶中，即得。

2.3 色谱条件和系统适应性实验 凝胶色谱柱：(TSK gel G2000SWXL 8.7 mm×30.0 cm)，柱温为30 ℃；以0.02 mol/L醋酸铵溶液-乙腈(90∶10)为流动相，流速为0.6 mL/min；采用Alltech ELSD2000ES检测器，检测条件为：漂移管温度120 ℃，氮气流速2.0 L/min；进样量10 μL。在上述条件[4-5]下，香丹注射液的吐温80色谱峰与其他色谱峰达到基线分离，理论塔板数超过3000，峰形对称。如图1所示。

A.吐温80对照品溶液；B.香丹注射液样品

2.4 线性关系考察 精密称取吐温80对照品溶液适量置容量瓶中，加流动相定量稀释成0.505 、1.01 、2.02、4.04、5.05 mg/mL吐温80的系列对照品溶液。精密吸取各种浓度对照品溶液10μL注入液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积的对数值对浓度的对数值作图，得到吐温80的回归方程Iny=5.5418Inx+11.227，R2=0.9991，线性范围为0.505～5.05 mg/mL。

2.5 精密度试验 精密吸取浓度为1.01 mg/mL的吐温80对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积，其相对保留时间稳定,6次进样得到吐温80峰面积的RSD为0.6%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取浓度为1.01 mg/mL的吐温80对照品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、10、24 h在上述色谱条件下测定。结果6次测量后，其峰面积的RSD为1.5%。表明吐温80在24 h内未出现降解，稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 取香丹注射剂6份，每份精密吸取5 mL，分别精密加入1.01 mg/mL的吐温80(Sigma)5 mL，按“2.2”项下的方法制备溶液，样品含量以及加入的含量详见表1，并按照以上的方法学测定吐温80的峰面积，计算得到吐温80的平均加样回收率为97.87%，RSD=1.8%。

表1 回收率试验结果

2.8 样品测定 根据以上方法学考察的结果，取不同批次的香丹注射液样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下方法进行含量测定。分别计算每份样品中吐温80的含量，详细结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

3.1 药用辅料与不良反应之间具有相关性 中药注射剂在临床上的严重不良反应时有报道，和药物本身的来源有一定的关联，比如药材的产地差异、药材种植中引入的重金属、农药残留、植物药材中可能产生的黄曲霉毒素等，同时也和中药成分的本身的复杂性有关[6-7]，在加上药物使用者的个体差异，引起不良反应的过敏原具有非常多的不确定性，但药用辅料也是其中一个不可忽视的重要环节，药用辅料的品质、纯度、质量、来源等，都和药物不良反应之间存在一定的相关性，准确的定量分析研究有助于药物的安全性评价和药物警戒研究。

3.2 规范注射液中吐温80含量的合理限度 吐温80作为增溶剂，在中药注射液中的应用十分普遍，由于其用量与不良反应存在相关性[8-9]，建立样品中吐温80的含量可以有效控制制剂质量，可以为临床用药安全提供参考标准，保证用药安全。以上研究给出了有效的吐温80检测方法，限度控制研究中，还需要更多的样品量进行统计学分析，样品中也应涵盖不同厂家和企业，同时对药品的原料进行分析检测，考察有关物质等，为了更准确合理的给出限度值，还需要结合临床表现和不良反应监测数据，以期更科学有效的对吐温80含量的限度进行规范。

3.3 色谱条件的合理优化 吐温80是一种非离子型表面活性剂，有增溶的作用，易溶于水和甲醇、乙酸乙酯和植物油类等有机溶剂，但由于吐温80属于聚合物，分子量较大，不适用常规的色谱柱进行分离，而且紫外扫描的数据表明，吐温80也没有明显的紫外吸收，常规的紫外检测器灵敏度不够，吐温80的含量检测，难以用常规的色谱方法进行分离、检测，试验中探索凝胶色谱柱进行分析，结合蒸发光散射检测器，需要对流动相体系的适用性进行验证，同时对流动相的流速和流动相体系中乙酸铵比例进行了考察[10-12]，试验中对比分析了醋酸铵-乙腈体系以及磷酸盐缓冲液体系，试验发现，选择0.02 moL/L醋酸铵溶液-乙腈(90∶10)体系作为流动相可以有效的改善色谱峰型，当流速为0.6 mL/min时，色谱图基线平稳，分离效果最佳，出峰时间合理。