新疆棉区田间棉铃虫种群对Bt Cry1Ac毒蛋白的敏感性研究

李海强，丁瑞丰，阿克旦·吾外士，刘 建，潘洪生，李号宾，王冬梅

(新疆农业科学院植物保护研究所，农业部库尔勒作物有害生物科学观测实验站，农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091)

棉铃虫Helicoverpaarmigera是危害棉花的一种重大的致灾性害虫。20世纪90年代曾在我国连年暴发几乎对所有化学农药产生抗性(吴孔明, 2005)。苏云金杆菌Bacillusthurigensis(Bt)产生的δ-内毒素对许多鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性，而对天敌和人畜很安全。自1997年转苏云金芽孢杆菌(Bt)基因棉花在我国首次商业化栽培以来，较好地控制了棉铃虫的为害，为棉铃虫的防控提供了一种安全有效的策略(张洋, 2010)。然而，长期大面积推广和种植，棉铃虫在整个生长期都受到了Bt棉体内持续表达的Bt杀虫蛋白的高压选择，棉铃虫将会对Bt棉演化出抗性(叶萱, 2004)。Kranthi(2006)报道从Bt棉花上采集棉铃虫种群后用Bt棉花叶片饲养1代，随后直接用含Bt Cry1Ac的饲料筛选了11代后发现，棉铃虫对Bt Cry1Ac的抗性达到205倍。虽然目前已有多种害虫检测到对蛋白产生了不同程度的抗性，但是至今为止，并没有发现因为害虫抗性的产生而导致转基因作物种植失败的情况，但是抗性演变问题不可忽视。因此，有必要进行棉铃虫对Bt的抗性监测，为棉铃虫的综合治理提供理论依据(Luttrell, 2012; Kennedy, 2017; Kukanur, 2018)。

棉铃虫对Bt毒蛋白抗性监测是一种有效的方法，其目的和意义在于明确Bt棉花是否仍然可以在新疆继续种植，并持续地压低棉铃虫的种群数量(Burd, 2003; Wu, 2007)。先前的学者已进行了大量的研究。2009-2013年，在长江流域棉区通过不含Bt毒素的人工饲料和含有1.0 mol/L Cry1A(c)毒素的饲料，共筛选了夏津2 837个棉铃虫家系和安次2 055个家系的生长速率，没有发现对Bt Cry1A(c)有抗性的棉铃虫个体(An, 2015)。2010-2011年利用相同的方法，研究了新疆棉铃虫对Bt棉的抗性频率进行了监测，结果表明新疆地区棉铃虫田间种群的抗性频率仍处于敏感水平(王冬梅, 2012)。张洋等(2010)利用改进的单雌系F1/F2代法，对黄河流域主要棉区河南安阳县、河北威县、山东武城县的棉铃虫种群进行了系统监测，结果表明，我国黄河流域这3个主要棉区田间棉铃虫种群对Cry1Ac毒素还没有产生明显的抗性，抗性基因频率仍处于正常水平。李国平等(2018)对河南省新乡市棉铃虫种群进行了Bt抗性频率监测，结果表明新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的敏感度增加，转Cry1Ac基因棉花仍处于较为敏感阶段。

新疆棉区是我国重要的棉花生产基地，近些年随着转基因棉花的引进和大面积种植，其对棉铃虫产生的抗性也备受关注。同时，棉铃虫对Bt Cry1Ac棉的敏感性的监测工作仍然开展较少。因此，有必要对新疆棉区棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性进行系统的监测。本文采用单雌系F1/F2代诊断剂量法于2013-2019年连续监测了新疆库尔勒市棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的抗性频率以及种群敏感度的变化。通过这些研究，可以明确上述地区棉铃虫种群对Cry1Ac的敏感程度，以及其抗性的演化过程，为制定切实可行的棉铃虫抗性治理措施提供参考，以保障转基因棉花在新疆有效、持久安全的利用。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

新疆库尔勒地区是新疆Bt棉花集中种植区之一。2013-2019年7月在新疆库尔勒地区利用1 000 W诱虫灯诱集2代棉铃虫成虫，总计446个棉铃虫单雌系作为供试虫源，用于棉铃虫种群对Cry1Ac抗性频率的监测。

1.2 供试Bt Cry1Ac蛋白

含Cry1Ac型Bt ICP 20%的MVPII水剂，由Mycogen公司提供，冻存于-20℃冰箱备用。

1.3 实验方法

采用F1/F2单雌系法：以Wu(1999)确定的1.0 μg/mL饲料为诊断浓度，并参照Burd(2003)的生物测定方法。在库尔勒试验基地诱集棉铃虫雌蛾，以10%蜂蜜水饲养在一次性水杯中，单头饲养后将每个雌蛾所产初孵幼虫30～35头接入1.0 μg/mL的Cry1Ac饲料中，以不加Cry1Ac的人工饲料作为对照，在温度27±2℃，相对湿度60%～70%，光周期14 L ∶10 D下饲养，6 d后观察幼虫发育级别，统计幼虫的发育级别。

F1代幼虫在Cry1Ac饲料上发育与在正常饲料上发育较相近的按10%的比例，将各个家系在正常饲料上存活幼虫分别保存下来，使其羽化，置于养虫笼中自交，进行F2代幼虫生物测定，方法同F1代幼虫生物测定。

1.4 数据处理

根据生物测定结果，计算每个家系幼虫在两种饲料上的相对平均发育级别，为消除环境条件的影响，相对平均发育级别为在Cry1Ac饲料上的平均发育级别除以在正常饲料上的平均发育级别。试验数据处理均采用SPSS 17.0数据处理系统进行分析。对不同年份的相对发育级别进行单因素方差分析，相同小写字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著。

F2代与F2代对应的F1代的相对平均发育级别利用单因素方差分析其差异显著性，F2代与F2代对应的F1代的相对平均发育级别相关性分析采用SPSS 17.0数据处理系统进行分析。

2 结果与分析

2.1 F1代棉铃虫种群的敏感性

2013-2019年库尔勒棉铃虫种群各家系在Cry1Ac上的相对平均发育级别(RADR)分布见图1。F1代棉铃虫中均未观察到RADR大于0.8的个体，RADR在0.3～0.6之间。

2013-2019年共测试库尔勒种群分别为60个、38个、48个、53个、59个、83个和105个雌性家系。F1代棉铃虫种群的RADRs分别为0.328、0.386、0.539、0.572、0.565、0.542、0.562。RADR从2015年开始明显的升高(见图1)，在2016年达到峰值0.572，然后逐渐下降到2019年的0.562，方差分析表明，2015-2019年棉铃虫的相对发育级别显著高于2013年和2014年(F(6 439)=44.39；P<0.0001)。表明，棉铃虫种群对Cry1Ac的RADR升高，抗性增加。

图1 不同年份F1代库尔勒棉铃虫种群相对发育级别Fig.1 RADR dynamics for each year in the F1 generation in the Korla populations during 2013-2019注：图中不同小写字母a，b代表在0.05水平差异显著，下同。Note: Different small letters in the figure were significantly at 0.05 level, the same as below.

2.2 F1代棉铃虫种群相对平均发育级别分布频次

2013-2014年棉铃虫F1代幼虫相对平均发育级别主要分布在0.2～0.5之间，2015年略有增加，其中相对平均发育级别为0.6的所占比例最高。至2016-2019年则主要分布在0.3～0.7之间，且相对发育级别为0.7的个体比例较2016年以前逐渐增加(图2)。

图2 棉铃虫F1代幼虫相对平均发育级别分布图Fig.2 RADR distribution for six-day-old larvae of Helicoverpa armigera F1 generation female lines on Cry1Ac diets in the Korla population during 2013-2019

2.3 F2代棉铃虫种群的敏感性

2013-2019年进行了F2棉铃虫种群的Bt Cry1Ac毒素的抗性的生物测定。结果表明，F2代棉铃虫种群相对平均发育级别为0.419～0.621，与其对应的F1代棉铃虫种群相比，除了2013年和2019年有明显差异，其余年份无差异(见表1)。在供试的F2代家系中，没有任何1个家系的相对平均发育级别达到0.8。

表1 库尔勒棉铃虫种群F1和F2代幼虫的相对平均发育级别

续表1 Continued table 1

相关性分析表明，F2代与F2代对应的F1代的相对平均发育级别间无明显相关性(R=0.229,P=0.084)，表明F2代棉铃虫种群的变化没有遗传。

3 结论与讨论

本文利用单雌系F1/F2代诊断法从2013-2019年连续对新疆库尔勒棉区棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的抗性频率进行了监测。结果发现库尔勒F1代和F2代棉铃虫均未发现相对平均发育级别大于0.8的个体，说明没有出现耐Cry1Ac蛋白的棉铃虫个体。这表明库尔勒地区棉铃虫种群仍处于敏感水平，抗性水平较低。Lietal.(2010年)在2005年、2006年和2009年对新疆库尔勒棉铃虫对Cry1Ac进行了抗性频率监测，结果表明，F1代的相对平均发育级别分别为0.31，0.32和0.49，棉铃虫种群仍处于敏感水平。Zhangetal.(2018)发现新疆棉铃虫对Cry1Ac的敏感性高于黄河流域和长江流域棉区。这些结果表明，新疆南疆地区棉铃虫种群的抗性频率较低，仍然处于对Cry1Ac蛋白敏感的阶段，这与本研究结果一致。

棉铃虫对Bt抗性是否形成取决于多种因素，如不同棉铃虫地理种群的密度、时空分布、Bt基因漂移等(Wu, 2007)。Liuetal.(2008)报道，2003年至2007年，在河北省邱县对棉铃虫抗性频率进行了抗性监测，结果表明，田间棉铃虫种群较实验室棉铃虫种群Cry1Ac产生抗性的等位基因的频率增加了12倍，密集种植含Bt Cry1Ac蛋白的棉花引起了棉铃虫抗性的增加(何丹军和刘凤沂等, 2001; Xuetal., 2009)。这可能是由于河北邱县自2001年以来Bt基因棉占总作物种植面积的85%以上造成的(潘利东等, 2013)。

棉花是新疆南部、北部和东部地区的主要作物，是农民的主要收入来源。然而，由于近年来作物结构的调整，棉花种植面积在减少，而其它经济作物种植面积在扩大。在莎车、阿克苏、哈密、伯乐、昌吉等地形成了多种农作物种植模式，各地棉花种植比重不断下降。多种作物的分布为棉铃虫提供了丰富的食物来源，还可以提供庇护所，进而减缓棉铃虫对Bt蛋白抗药性的发展速度(Wan P, 2012; Wang, 2018)。因此，天然避难所在棉铃虫的抗性管理中起着非常重要的作用(Jinetal., 2015; Takahashietal., 2016)。

转Cry1Ac基因棉对棉铃虫存在明显控制效果，目前种植转基因棉大多数为转单价基因品种，因此棉铃虫对转基因棉比对常规棉田化学农药更易产生抗性。一旦棉铃虫对转基因棉产生抗性，转基因抗虫棉就会失去价值。新疆库尔勒地区当地主要以种植棉花为主，棉花栽培面积较大，且连年种植很有可能导致棉铃虫对Bt蛋白的敏感性下降。因此，为了确保Bt棉花能够在新疆可持续安全种植仍需继续监测棉铃虫对Bt棉花的抗性变化，为棉铃虫的综合治理提供理论依据。