lncRNA MIR34AHG通过miR-296-5p/SRCIN1轴影响喉癌细胞的恶性生物学行为

张 杨 范崇盛 郭 洁 赵 丹 魏珍星

喉癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，喉癌的发生率在我国呈逐年上升趋势[1]。尽管喉癌的整体治疗水平近年来有所提高，然而其总体生存率较差[2]。喉癌的发生和发展是一个非常复杂的过程，阐明喉癌的发病机制和研发新的靶向治疗已成为亟待解决的问题。长链非编码RNA(lncRNA)是一类新型的内源性非编码RNA，在真核细胞中高度表达[3]。lncRNA可以充当miRNA海绵，参与调节细胞代谢、黏附、分化、凋亡、信号转导等生物学行为[4]。针对不同的靶基因和肿瘤类型，lncRNA既可作为肿瘤抑制因子又可作为癌基因[5]。近年来研究发现，MIR34AHG与肺腺癌患者的生存期有关，其可作为肿瘤抑制因子参与肺腺癌的发生和进展[6]。MIR34AHG在喉癌中表达和作用机制研究甚少，本研究旨在研究MIR34AHG在喉癌细胞系中的表达，探讨MIR34AHG影响喉癌细胞增殖和迁移的分子机制。

材料与方法

1.细胞系和主要试剂:支气管上皮细胞系(16HBE)和喉癌细胞系(TU686、Hep-2、TU177、AMC-NH-8、TU212)购自中国典型培养物保藏中心。SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自美国Roche公司。阴性对照质粒、MIR34AHG过表达质粒、MIR34AHG野生型报告基因载体(WT)、突变型报告基因载体(MUT)、miR-296-5p mimics、miR-NC购自上海吉玛制药技术有限公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma公司。SRCIN1、GAPDH、Wnt1、β-catenin、MMP-9蛋白抗体购自美国CST公司。

2.细胞培养和转染:所有细胞均用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，均置于37℃、5%CO2培养箱。取对数期的TU686细胞，按照转染试剂说明书将50ng阴性对照质粒和MIR34AHG过表达质粒分别转染至TU686细胞，分为对照组和MIR34AHG组。48h后进行后续实验。

3.qPCR检测MIR34AHG、miR-296-5p和SRCIN1 mRNA表达:用Trizol试剂提取细胞样本总RNA，反转录为cDNA后使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qPCR扩增。U6作为内参检测miR-296-5p的表达，GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，qPCR引物序列详见表1。

表1 qPCR引物序列

4.MTT法检测MIR34AHG表达对TU686细胞增殖的影响:将两组稳定转染TU686细胞铺至96孔板，培养1、2、3、4、5天时，将10μl MTT溶液添加至每孔，孵育4h，吸去上清，将100μl DMSO溶液添加至每孔，摇床振荡15min，使用自动酶标仪检测450nm波长处各孔的吸光度(A)值。

5.细胞划痕实验检测MIR34AHG表达对TU686细胞迁移的影响:将两组稳定转染TU686细胞铺至24孔板，用移液枪枪头在孔底划痕。用PBS溶液洗3次，添加无血清培养基，置于培养箱培养。于0和24h取样，在倒置显微镜下拍照、测量划痕宽度。

6.双荧光素酶报告基因实验验证MIR34AHG与靶基因之间的靶向关系:通过starBase v2.0数据库分析MIR34AHG的靶基因可能是miR-296-5p，miR-296-5p的靶基因可能是SRCIN1。分别将MIR34AHG-WT、MIR34AHG-MUT与miR-296-5p mimics或miR-NC共转染至TU686细胞中。48h后，采用双荧光素酶活性检测试剂盒检测TU686细胞的荧光素酶活性。

7.Western blot法检测SRCIN1蛋白表达:用RIPA裂解液裂解并提取两组TU686细胞总蛋白，蛋白高温变性后上样，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳和硝酸纤维素膜转膜，用5%脱脂奶粉封闭，加入一抗在4℃孵育过夜。加入二抗山羊抗兔IgG抗体(1∶5000稀释)，室温孵育2h，用凝胶成像系统曝光、显影。

结 果

1.MIR34AHG在支气管上皮细胞和喉癌细胞系的表达:qPCR检测结果显示，与16HBE细胞比较，在5种喉癌细胞系中均观察到MIR34AHG低表达(P<0.05或P<0.01)，其中，TU686细胞中MIR34AHG表达最低(P<0.01)，故选择TU686细胞进行后续实验(图1)。

图1 MIR34AHG在支气管上皮细胞和喉癌细胞系中的表达与16HBE细胞比较，*P<0.01

2.转染MIR34AHG过表达质粒明显促进MIR34AHG的表达:qPCR检测结果显示，对照组和MIR34AHG组TU686细胞中MIR34AHG表达量分别为1.15±0.32和13.31±1.47(P<0.01)，表明成功构建MIR34AHG过表达细胞系。

3.过表达MIR34AHG可抑制TU686细胞的增殖:MTT检测结果显示，与对照组比较， MIR34AHG组TU686细胞增殖从第2天开始明显降低(P<0.05或P<0.01)，表明过表达MIR34AHG可抑制TU686细胞的增殖(图2)。

图2 过表达MIR34AHG对喉癌细胞TU686增殖的影响与MIR34AHG组比较，*P<0.05，**P<0.01

4.过表达MIR34AHG可抑制TU686细胞的迁移:细胞划痕实验检测结果显示，对照组和MIR34AHG组TU686细胞迁移率分别为62.98%±3.21%和34.57%±6.64%(P<0.01)，表明过表达MIR34AHG可抑制TU686细胞的迁移能力(图3)。

图3 过表达MIR34AHG对喉癌细胞TU686迁移的影响

5.MIR34AHG与靶基因之间的靶向关系:生物信息学工具(图4)显示，miR-296-5p可能是MIR34AHG的候选目标，miR-296-5p的靶基因可能是SRCIN1。双荧光素酶报告基因实验检测结果表明，与miR-NC比较，miR-296-5p mimics显著抑制了携带MIR34AHG-WT的荧光素酶活性(P<0.01，图5)。

图4 生物信息学工具预测MIR34AHG的靶基因

图5 双荧光素酶报告基因实验验证MIR34AHG与靶基因的结合

6.过表达MIR34AHG可调控miR-296-5p、SRCIN1 mRNA的表达:对照组和MIR34AHG组TU686细胞中miR-296-5p相对表达量分别为1.05±0.19和0.31±0.06，MIR34AHG负调控miR-296-5p的表达(P<0.01)。对照组和MIR34AHG组TU686细胞中SRCIN1 mRNA表达量分别为1.03±0.14和5.44±0.56，MIR34AHG正调控SRCIN1 mRNA的表达(P<0.01)。

7.过表达MIR34AHG对SRCIN1蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响:Western blot法检测结果显示，与对照组比较，转染MIR34AHG后，SRCIN1蛋白表达增加，Wnt/β-catenin信号通路蛋白Wnt1、β-catenin、MMP-9表达降低(图6)。

讨 论

lncRNA是由超过200个核苷酸构成的单链RNA，由于缺乏开放阅读区，不具有编码蛋白的功能[7]。lncRNA可通过调节细胞的各种生物学功能，在疾病的发展、转归中发挥重要作用[8]。越来越多的研究显示，喉癌细胞中存在大量lncRNA的异常表达，lncRNA有可能作为喉癌新型的生物学标志物或治疗靶点[9]。Huang等[10]研究表明，喉癌组织中lncRNA-ATB的表达明显增强，其与患者的临床分期，高表达lncRNA-ATB的患者总生存率明显低于低表达患者。Zheng等[11]研究表明，喉癌组织中的LINC00152表达水平显著高于邻近正常组织，敲低LINC00152敲低显著抑制了喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞的凋亡，miR-613是LINC00152的靶基因。研究发现，MIR34AHG由4211个核苷酸组成，其在肺腺癌中呈低表达，MIR34AHG表达较高的患者总体生存期较长，MIR34AHG可作为肺腺癌患者的独立预后因素[6]。本研究发现，在喉癌细胞系中MIR34AHG表达显著低于人支气管上皮细胞，MIR34AHG可能参与喉癌的发生、发展。通过构建MIR34AHG过表达细胞系，过表达MIR34AHG可显著抑制TU686细胞的增殖和迁移能力，MIR34AHG在喉癌细胞中具有抑癌作用。

lncRNA通过海绵作用以不完全配对方式结合miRNA，抑制miRNA的表达[12]。本研究借助生物信息学工具预测MIR34AHG与miR-296-5p存在结合位点，双荧光素酶报告基因检测进一步证实了MIR34AHG与miR-296-5p的靶向关系。研究发现，miR-296-5p在喉癌组织中表达增加，miR-296-5p高表达与喉癌放疗抵抗和复发呈正相关，miR-296-5p可能成为喉癌预后不良的指标[13]。本研究显示，过表达MIR34AHG后TU686细胞中miR-296-5p表达降低，提示MIR34AHG直接靶向负调控miR-296-5p的表达。miRNA主要在转录后水平互补结合靶基因mRNA，抑制靶基因的表达[14]。本研究借助生物信息学工具预测miR-296-5p与SRCIN1 mRNA存在结合位点。SRC激酶信号抑制剂1(SRCIN1)基因定位于染色体17q21.1，SRCIN1蛋白由两个高电荷氨基酸区域、两个富含脯氨酸的区域及两个螺旋结构域构成[15]。SRCIN1在多种肿瘤如胰腺癌、非小细胞肺癌中呈现低表达，在肿瘤中起着抑癌基因作用[16]。Wnt/β-catenin信号通路在喉癌细胞中被异常激活，加速喉癌细胞恶性发展[17]。SRCIN1蛋白可拮抗Wnt/β-catenin信号通路活性，抑制结直肠癌的发生和发展[18]。本研究显示，MIR34AHG下调miR-296-5p表达后，SRCIN1基因表达明显增加，Wnt/β-catenin信号通路被抑制。

综上所述，MIR34AHG在喉癌细胞系中表达下调，过表达MIR34AHG通过miR-296-5p/SRCIN1轴，拮抗Wnt/β-catenin信号通路，抑制喉癌细胞的增殖和迁移，MIR34AHG可能是喉癌治疗潜在的靶点。