不同性质的肺部磨玻璃结节患者炎症和免疫因子水平的比较研究

李 杰，王 兰

(江苏省江阴市人民医院呼吸与危重症医学科，江苏 江阴 214400)

肺癌已经成为全球及我国发病率和致死率最高的肿瘤，发病率逐年增加[1]。肺部磨玻璃结节指的是在高分辨率CT图像上表现为肺内密度轻度增加，呈局灶性云雾状密度的结节，其内的支气管及血管束可显示。随着影像学技术的不断完善和广大居民体检意识的日益提高，肺部磨玻璃结节的发病率在日益增加。很多医院还专门设立了肺部磨结节的多学科门诊。在CT扫描中发现的肺部磨玻璃样变性当中最终有一部分确诊为恶性肿瘤。对于肺部磨玻璃结节的性质鉴别是当前临床工作的一个难点，寻找一种简便、无创的方法联合CT检查发现结节的不同影像学特征来鉴别肺部磨玻璃结节的性质是研究的方向。已有研究显示肺癌患者的肺组织当中存在有慢性炎症[2-3]，各种炎症因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)参与了肺损伤和疾病进展。本研究通过比较不同性质的肺部磨玻璃结节患者血清当中的炎性及免疫因子的水平，为肺部磨玻璃结节性质的鉴别诊断探索一种新的方法。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选取2018年2月—2019年1月我院收治的肺部磨玻璃结节患者108例，所有患者之前均未接受过放化疗及手术治疗，均排除存在各种感染和自身免疫系统疾病，近期曾使用激素及免疫抑制剂以及存在其他部位肿瘤的患者。由2名长期从事CT诊断的影像科主任医师对所有入选患者的影像进行判读，通过胸外科手术明确肺部结节性质，根据病理结果和CT表现分为肺癌组(A组)、良性多发磨玻璃结节组(B组)、良性孤立性肺部磨玻璃样结节组(C组)。3组性别、年龄、平均动脉压、体重指数差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 3组患者一般资料比较Table 1 Comparison of general information of three groups

1.2研究方法

1.2.1实验室设备和试剂 主要实验室设备：酶标仪、流式细胞仪、特定蛋白质仪器。相关试剂盒：TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10试剂盒，Multiset三色试剂，λ型轻链测定试剂盒和κ型轻链测定试剂盒。

1.2.2炎症因子检测 收集清晨空腹静脉血3～5 mL，将血清提取并储存在-80 ℃的冰箱中。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。①样品稀释：在ELISA板上设置10个标准孔，并将100 μL样品分别加入第1和第2孔中，分别加入50 μL稀释溶液。从第1孔及第2孔中取100 μL样品，并分别加入到第3孔和第4孔中，分别加入50 μL稀释溶液。接下来，从第3个和4个孔取50 μL样品并加入到5和6个孔中，分别加入50 μL稀释溶液。将样品稀释5倍，最后得到稀释样品。②加样和孵育：将稀释的样品加入样品孔中，膜封闭后在37 ℃孵育30 min; 然后将板洗涤5次(20 s/次)；③酶促温育：加入50 μL酶标记的试剂在37 ℃孵育30 min，然后洗涤板5次(20 s/次)；④显色和终止：将彩色显影剂A和B(每个50 μL)加入到标准孔中以在20 ℃温育15 min，然后加入50 μL终止缓冲液。使用酶标仪(波长450 nm)在15 min内读取光密度(optical density，OD)值，并计算TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。

1.2.3T淋巴细胞亚群水平检测 收集清晨空腹静脉血3～5 mL，样品中白细胞(white blood cell,WBC)数量控制在(4～10)×109/L。当WBC<4×109/L时，加入4 mL淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min分离单个核细胞；当WBC>10×109/L时，使用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS)溶液进行稀释。根据多重三色试剂盒的说明，将5 μL CD3-PC5/CD4-RD1/CD45-PITC和CD3-PC5/CD8-ECD/CD45-PITC分别加入2个TruCount管中，将40 μL样品加入到2个TruCount管中并充分混合，然后在20 ℃温育15 min；然后加入500 μL FACS溶血素并充分混合，然后在20 ℃在黑暗处温育15 min；在2 500 r/min离心3 min后取上清液，然后加入300 μL 9%氯化钠溶液。使用流式细胞仪检测CD3+、CD4+和CD8+水平，并计算CD4+/CD8+比率。

1.2.4免疫球蛋白检测 收集清晨空腹静脉血2～3 mL，完全凝集并以2 000 r/min离心10 min。 取上清液，加入9%氯化钠，加入稀释溶液。 根据特定蛋白质仪器的说明进行免疫比浊法测定，自动检测免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)水平。

1.3统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件处理数据。计量资料比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13组患者炎症因子指标比较 A组、B组患者TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平显著高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组与B组患者TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.23组患者T淋巴细胞亚群水平比较 A组、B组患者CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平显著低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组和B组CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.33组患者免疫指标比较 A组、B组患者IgG、IgA、IgM水平显著低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组与B组患者IgG、IgA、IgM水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表2 3组患者炎症因子指标比较Table 2 Comparison of inflammatory factors in three groups

表3 3组患者T淋巴细胞亚群水平比较Table 3 Comparison of the levels of T lymphocyte subsets in three groups

表4 3组患者免疫指标比较Table 4 Comparison of immune indexes of three groups

3 讨 论

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率逐年增加，已成为许多国家危及人类健康的主要恶性肿瘤。2015年我国新发肺癌病例约为78.7万例，发病率为57.26/10万，是男性发病首位，女性发病第2位的恶性肿瘤。因肺癌死亡的例数居我国恶性肿瘤死亡首位，2015年我国因肺癌死亡例数约为63.1万例，病死率为45.87/10万。17个癌症注册中心的数据分析显示，我国肺癌患者的年龄标化5年相对生存率由2003—2005年的16.1%仅增加至2012—2015年的19.7%。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)在肺癌中的比例高，约占85%，手术治疗的Ⅰ～Ⅲa期NSCLC患者术后1年生存率可达70%，5年生存率可达30%。然而，其中超过70%的NSCLC患者就诊时已有局部或远处转移(Ⅲb～Ⅳ期)，失去手术切除的机会，说明早期诊治尤为重要[4-5]。近年来肺部磨玻璃结节的研究越来越受到关注，但其病理诊断常遇到困难，有学者认为肺部磨玻璃的变化应该列入肺癌前病变研究。影像学检查是发现早期肺磨玻璃结节的主要方法之一。肺磨玻璃结节的病因很多，包括吸烟、空气污染和遗传因素等[6-7]。TNF-α是由单核/巨噬细胞分泌的一种可溶性多肽细胞因子。当机体受损、感染或患有某些肿瘤时，机体会产生大量TNF-α，血清浓度也会增加，从而引发炎症反应[8]。IL-1是白细胞介素家族的成员，包括IL-1α和IL-1β，可刺激T细胞产生各种炎症因子[9]。IL-6是白细胞介素家族的重要成员，其释放对肺部疾病是一个危险信号[10]。IL-10水平升高可导致机体处于体液免疫的高反应状态，在多种肿瘤中均高表达[11]。本研究显示，肺癌与良性的弥漫性磨玻璃结节患者中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平差异无统计学意义，且均明显高于良性孤立性磨玻璃结节患者。原因可能是肿瘤细胞激活单核细胞的浸润和转移，促进TNF-α的分泌。TNF-α与IL-1β、IL-6和IL-10等炎症介质发生作用，增强炎症反应。弥漫性肺部磨玻璃结节也会出现肺组织损伤，故TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平、也较高，接近肺癌。孤立性肺部结节无纤维化改变和间质炎症反应，所以炎症因子水平较低，但仍然不容忽视。IgG是一种在抗感染中起主要作用的抗菌和抗病毒抗体；IgA可以形成局部免疫；IgM是一种能溶解致病菌，凝集和吞噬作用的高效抗体，在早期防御中发挥重要作用[12-13]。肺癌患者与良性弥漫性肺部磨玻璃结节患者的IgG、IgA和IgM水平差异无统计学意义，且均显著低于孤立性磨玻璃样结节患者。原因可能是因为免疫球蛋白直接中和TNF-α，阻断抗原抗体反应,减少炎症因子释放。肺癌与良性肺部弥漫性磨玻璃结节患者中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平高，导致IgG、IgA和IgM水平降低。T淋巴细胞亚群中的CD3+是成熟T细胞表面上的抗原呈递，可以辅助鉴定T细胞抗原受体。CD4+是具有免疫调节功能的辅助T细胞，CD8+T细胞可导致免疫功能障碍的细胞毒性T细胞[14-15]。肺癌患者和良性弥漫性磨玻璃样结节患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平差异无统计学意义，明显低于良性孤立性磨玻璃样结节患者。原因可能是T淋巴细胞亚群的水平与肺癌的发生、发展和转移密切相关，患者常常患免疫失衡和免疫功能低下。CD3+、CD4+和CD8+在肺微环境中处于平衡状态，它能正常调节机体的细胞免疫应答，受多种炎症细胞因子影响，其表达水平会发生改变; 炎症越严重，平衡越受到损害，并且会产生显着的免疫抑制，从而减少其数量。 随着肺部疾病的不断进展，CD4+/CD8+比率明显下降，诱导失衡，引起肺组织病理生理改变[16]。对于肺部磨玻璃结节的患者，检测血清中的炎症及免疫指标可能可以成为预测结节良恶性的一个辅助参考因素，但是需要扩大样本数量开展进一步研究，及同无结节的健康人作比较进行分析。

综上所述，肺癌和良性肺部弥漫性磨玻璃结节患者的炎症因子水平显著高于良性单发磨玻璃结节患者，免疫因子的水平显著低于良性单发磨玻璃结节患者。检测肺部磨玻璃结节患者血清中炎症因子和免疫因子水平可考虑作为鉴别肺部磨玻璃结节良恶性的一种辅助手段。影像学结合血清学检查可为肺癌的鉴别诊断提供较好的依据，实现对肺癌病变的早期干预，具有重要的临床意义。