唑来膦酸拮抗D-半乳糖诱导成骨细胞损伤的作用

蔡林秀　常俊杰　解强　张曦　王亚晶　高俊

【摘要】 目的：探究唑来膦酸对D-半乳糖导致成骨细胞损伤的拮抗作用。方法：以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为研究对象，以MTT法观察不同浓度梯度（15、20、30 mg/mL）D-半乳糖及不同浓度梯度（10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3mol/L）唑来膦酸对成骨细胞活性的影响。以20 mg/mL

D-半乳糖环境培养成骨细胞建立D-半乳糖导致成骨细胞损伤模型，观察不同浓度梯度（0.01、0.05、0.1、0.25、0.5 μmol/L）唑来膦酸对D-半乳糖导致成骨细胞活性损伤的拮抗作用。結果：随着D-半乳糖浓度的升高（15、20、30 mg/mL），成骨细胞活性逐渐减弱。与对照组相比，较低浓度的（10^-8、10^-7mol/L）唑来膦酸干预下的实验组成骨细胞活性升高（P<0.05），而较高浓度的（10^-5、10^-4、10^-3mol/L）唑来膦酸干预下的实验组成骨细胞活性降低（P<0.000 1）。以0.01、0.05 μmol/L

的唑来膦酸干预48 h后的实验组成骨细胞活性均较模型组升高（P<0.05）。结论：D-半乳糖能够导致成骨细胞活性下降。0.01、0.05 μmol/L唑来膦酸对D-半乳糖导致成骨细胞活性损伤具有拮抗作用。

【关键词】 唑来膦酸 D-半乳糖 成骨细胞

Antagonistic Effect of Zoledronate on Osteoblast Injury Induced by D-galactose/CAI Linxiu， CHANG Junjie， XIE Qiang， ZHANG Xi， WANG Yajing， GAO Jun. //Medical Innovation of China， 2022， 19（07）： 027-032

[Abstract] Objective： To investigate the antagonistic effects of Zoledronate on the inhibition of osteoblasts viability induced by D-galactose. Method： Taking mouse osteoblast MC3T3-E1 as the research object， the effects of different concentration gradients （15， 20， 30 mg/mL） of D-galactose and different concentration gradients （10^-8， 10^-7， 10^-6， 10^-5， 10^-4， 10^-3mol/L） of Zoledronate on osteoblast activity were observed by MTT method. Osteoblasts induced by D-galactose were cultured in 20 mg/mL D-galactose environment to establish an osteoblast injury model， and the antagonistic effect of Zoledronate on the activity of D-galactose induced osteoblasts was observed at different concentration gradient （0.01， 0.05， 0.1， 0.25， 0.5 μmol/L）. Result： With the increase of D-galactose concentration （15， 20， 30 mg/mL）， the activity of osteoblasts decreased gradually. Compared with the control group， the osteoblast activity of the experimental groups with lower concentration （10^-8， 10^-7 mol/L） of Zoledronate were increased （P<0.05）， while the osteoblast activity of the experimental groups with higher concentration （10^-5， 10^-4， 10^-3mol/L） Zoledronate were decreased （P<0.000 1）. The osteoblast activity of the experimental groups were treated by 0.01 and 0.05 μmol/L

Zoledronate for 48 h were higher than that in the model group （P<0.05）. Conclusion： D-galactose can decrease osteoblast activity. 0.01 and 0.05 μmol/L Zoledronate have antagonistic effect on D-galactose induced osteoblast activity injury.gzslib202204021641

[Key words] Zoledronate D-galactose Osteoblast

First-authors address： Changzhou Chinese Traditional Medicine Hospital Affiliated to Chinese Traditional Medicine University of Nanjing， Changzhou 213003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.07.007

骨质疏松症是一种由于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收平衡失调造成骨组织微观结构恶化、骨量减少、骨强度降低的一种慢性骨代谢疾病[1]。双膦酸盐（bisphosphonates，BPs）是临床首选使用的治疗骨质疏松症最有效的药物之一[1]。唑来膦酸属于含氮双膦酸盐，目前已有大量研究提供证据支持唑来膦酸通过抑制破骨细胞的形成和促进成熟破骨细胞的调亡调节骨吸收，从而在提高骨密度、促进骨愈合、预防骨质疏松继发性骨折等方面发挥积极作用，但其对于成骨细胞的影响仍有诸多不同观点[2-4]。

半乳糖是一种还原糖，机体内适量的D-半乳糖可以经由肝脏途径代谢，过量堆积的D-半乳糖则无法代谢，随后转化形成晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）在组织中蓄积，从而诱导细胞的损伤[5]。AGEs是一类由还原糖以及蛋白质、脂类或核酸在非酶促反应下形成的一种复合物。年龄、饮食等因素都会影响个体代谢过程中的糖基化反应产生AGEs，蓄积在人体中的AGEs已经被证实在一些慢性疾病中起着关键的病理生理作用[6]。近年来国外有研究关注蛋白质无酶糖基化可能影响骨重塑的假说，认为AGEs能通过与特定的受体结合触发下游信号通路促进氧化应激等反应，造成细胞损伤，影响骨代谢平衡[7]。

在本研究中，笔者采用MTT法检测不同浓度D-半乳糖对成骨细胞活性的影响，选取合适的浓度建立D-半乳糖诱导的成骨细胞损伤模型。检测不同浓度唑来膦酸对成骨细胞的活性水平的影响，以及不同浓度唑来膦酸对D-半乳糖诱导成骨细胞活性水平损伤的影响。评估不同浓度的唑来膦酸对D-半乳糖诱导下成骨细胞损伤的拮抗作用，旨在为进一步研究唑来膦酸对成骨细胞的影响及影响机制提供合理的参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠成骨细胞株MC3T3-E1、α-MEM培养基购于上海中乔新舟生物科技公司;胎牛血清购于南京锦在生物科技公司;0.25%含EDTA胰蛋白酶、青/链霉素混合液、PBS缓冲液、MTT试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司;D-半乳糖、唑来膦酸单水化合物购于上海阿拉丁生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞培养 将冻存的MC3T3-E1细胞复苏，接种于含10%胎牛血清、1%青/链霉素的α-MEM培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2的细胞恒温培养箱中培养。待细胞生长至密度达到80%后，采用0.25%的胰蛋白酶进行细胞传代，隔天换液1次。

1.2.2 MTT法检测不同浓度D-半乳糖对成骨细胞活性的影响 取处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，利用酶消化法制备细胞悬液。调整细胞浓度后以每孔100 μL（5×103个/孔）接种入96孔板。设置不同浓度梯度的D-半乳糖为实验组（15、20、30 mg/mL），同时设置0 mg/mL D-半乳糖为对照组。每组设置6个复孔板。静置于细胞培养箱中培养24 h。随后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续孵育4 h。孵育时间结束后，每孔加入150 μL Formazan溶解液（formazan solvent），摇床震荡10 min，促使蓝紫色沉淀完全溶解。最后在酶联免疫检测仪上检测每个孔的吸光度值（OD值），检测波长为570 nm。细胞存活率（%）=[（测定组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）]×100%。

1.2.3 MTT法检测不同浓度唑来膦酸对成骨细胞活性的影响 将MC3T3-E1成骨细胞以每孔100 μL（5×10³个细胞/孔）接种入96孔板。设置不同浓度梯度的唑来膦酸为实验组（10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3mol/L），同时设置不加药物干预为对照组。每组浓度设置6个复孔，于37 ℃细胞培养箱中培养48 h后，用上述MTT法测定成骨细胞活性。

1.2.4 MTT法检测不同浓度唑来膦酸对D-半乳糖誘导的成骨细胞活性损伤的影响 将MC3T3-E1成骨细胞以每孔100 μL（5×10³个细胞/孔）接种入96孔板。将细胞分为正常组、模型组及实验组，正常组仅加入培养基，模型组加入浓度为20 mg/mL的D-半乳糖，实验组加入浓度为20 mg/mL的D-半乳糖及终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.25、0.5 μmol/L的唑来膦酸。每组均设置6个复孔，于相同条件下培养48 h后，用上述MTT法检测细胞活性。

1.3 统计学处理 所有实验数据均以（x±s）表示，应用GraphPad Prism7软件对实验数据进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。相关图形应用GraphPad Prism7软件绘制。

2 结果

2.1 不同浓度D-半乳糖对成骨细胞活性的影响 对照组（0 mg/mL）的细胞活性为（100.00±10.16）%，随着D-半乳糖浓度的升高（15、20、30 mg/mL），成骨细胞活性逐渐减弱，分别为（107.60±5.15）%、（87.79±3.85）%、（74.31±3.27）%。当D-半乳糖浓度增加到20 mg/mL时，实验组细胞活性低于对照组（P<0.05）。当D-半乳糖浓度增加到30 mg/mL时，实验组成骨细胞活性显著低于对照组（P<0.000 1）。见图1。gzslib202204021641

2.2 不同浓度唑来膦酸对成骨细胞活性的影响 浓度为10^-8、10^-7mol/L的实验组成骨细胞活性为（113.90±6.86）%、（112.62±7.50）%，均高于对照组（100.00±9.88）%（P<0.05）。浓度为10-6 mol/L的实验组成骨细胞活性（100.50±7.04）%与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。浓度为10^-5、10^-4、10^-3mol/L的实验组成骨细胞活性为（50.48±3.65）%、（5.42±0.62）%、（4.75±1.13）%，均显著低于对照组（P<0.000 1）。见图2。

2.3 不同浓度唑来膦酸对D-半乳糖诱导的成骨细胞损伤的影响 与正常组成骨细胞活性（100.00±10.66）%相比，模型组（56.73±11.54）%显著降低（P<0.000 1）。以浓度为0.01与0.05 μmol/L唑来膦酸干预48 h后的实验组成骨细胞活性为（76.60±10.76）%、（75.92±13.02）%，均高于模型组（P<0.05）。0.1 μmol/L的实验组成骨细胞活性（56.41±9.40）%与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。0.5 μmol/L的实验组成骨细胞活性为（38.52±12.06）%低于模型组（P<0.05）。见图3。

3 讨论

D-半乳糖是目前公认的糖类致衰诱导剂，被广泛应用于衰老动物模型构建和体外细胞衰老模型的复制。在体外，经D-半乳糖干预的细胞表现出线粒体功能失调、过度晚期糖基化产物形成和氧化应激等特征[5]。在体内，高水平的D-半乳糖能够诱导包括大脑、心脏、肝脏、骨骼、骨骼肌等不同器官和组织发生炎症、线粒体功能障碍及细胞凋亡等变化[5]。D-半乳糖造成细胞损伤的一个机制是过高水平的D-半乳糖因无法正常代谢，与大分子蛋白质或肽的游离氨基结合不可逆的转化为AGEs，大量积聚的AGEs通过与晚期糖基化终产物受体（receptor for AGEs，RAGE）结合，启动下游信号级联反应，引起细胞和组织损伤[5-8]。

AGEs已被证实在骨质疏松症、神经退行性疾病、动脉粥样硬化和某些肿瘤的发病发展机制中发挥作用，骨骼组织和细胞在人体中更新相对缓慢，随着年龄增长和外部环境多因素影响，骨组织易受到累积的AGEs影响[6，10]。有研究表明AGEs-RAGE轴对细胞的作用机制为二者结合后促进细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，再激活多条细胞内信号转导通路，触发核转录因子κB（nuclearfactor-kappaB，NF-κB）、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）等细胞内传导通道的活化，引起大量促炎细胞因子、生长因子和黏附分子等的表达和释放，激活炎症过程，触发细胞分解代谢失衡，最终抑制细胞增殖或诱导凋亡，使骨重塑紊乱[6，11-12]。Meng等[13]通过对人成骨细胞hFOB1细胞系的研究发现，低剂量AGEs修饰的牛血清白蛋白刺激成骨细胞增殖，高剂量AGEs修饰的牛血清刺激细胞凋亡，提出AGEs主要通过RAGE/Raf/MEK/ERK（receptor of advanced glycation end products/Raf protein/mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase/extracellular signal-regulated kinase）通路影响成骨细胞的增殖。另有一项研究证明一种典型的晚期糖基化产物戊糖苷对成骨细胞活性具有剂量依赖性负性调节作用[5]。本研究中，以含D-半乳糖培养基对成骨细胞进行体外培养，成骨细胞活性检测的结果表明随着半乳糖浓度（15、20、30 mg/mL）的升高，D-半乳糖對成骨细胞活性的抑制作用增加。

双膦酸盐是一类目前临床上应用最为广泛的抗骨质疏松症药物，唑来膦酸是双膦酸盐第三代药物，唑来膦酸的分子结构式中含有杂环结构的氨基，这使其在抗骨质疏松治疗方面比不含氮的双膦酸盐类药物疗效更佳，是目前治疗骨质疏松性症的临床一线用药[1-2]。以往诸多研究已经证明了唑来膦酸通过抑制核因子-κB配体受体激活剂（receptor activator of nuclear factor kappa-B，RANKRANKL）诱导的NF-κB活化和c-Jun氨基末端激酶磷酸化信号通路，抑制破骨细胞分化生成来调节骨代谢[2-4]。

然而，唑来膦酸对成骨细胞的影响尚存在许多不同观点。有研究表明唑来膦酸作为一种含氮BPs能够刺激成骨细胞的活性，调节多种生长因子和细胞因子的分泌，促进骨髓基质细胞向成骨细胞系的分化，并能够抑制糖皮质激素作用后的成骨细胞凋亡[14-15]。Basso等[16]以人成骨细胞MG63细胞系为研究对象，发现唑来膦酸对成骨细胞的细胞毒性作用表现为电子显微镜下成骨细胞形态改变，以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨钙素（osteocalcin，OCN）的基因表达下降。该研究者的另一项研究评估了接种于经不同浓度唑来膦酸预处理钛板上的人成骨细胞细胞黏附性和细胞活性，结果显示接种到经0.5及1.5 ?mol/L浓度唑来膦酸处理后钛盘上的成骨细胞存活率均降低[17]。Huang等[18]研究结果显示高浓度（>10 ?mol/L）的唑来膦酸诱导成骨细胞凋亡，低浓度（≤1 ?mol/L）的唑来膦酸通过下调BMP-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）抑制成骨细胞的分化。Scala等[15]比较双膦酸盐、阿仑膦酸和利塞膦酸对破骨前样细胞RAW264.7和成骨前样细胞MC3T3-E1的影响，研究结果显示3×10^-8、3×10^-7mol/L的唑来膦酸能提高成骨细胞MC3T3-E1的细胞活性并诱导显著的矿化。Acil等[19]评估唑来膦酸和阿仑膦酸对人成骨细胞、人牙龈成纤维细胞和人骨肉瘤细胞系的凋亡和促炎细胞因子基因表达情况的研究结果显示，在唑来膦酸给药下成骨细胞的增殖和细胞活力以剂量依赖性方式受到负面影响，且表现出炎症细胞因子IL-6、IL-12表达的增加。诸多有关唑来膦酸对成骨细胞作用相关研究结果表现出不同结论，所以针对唑来膦酸对成骨细胞作用的深入研究具有较大意义。本研究结果显示较低浓度的（10^-8、10^-7mol/L）唑来膦酸有促进成骨细胞活性的作用，较高浓度的（10^-5、10^-4、10^-3mol/L）唑来膦酸则对成骨细胞的活性的表现出显著的抑制作用，推测唑来膦酸对成骨细胞活性的影响可能与浓度有关，其具体浓度范围及作用机制仍有待进一步的研究。gzslib202204021642

双膦酸盐能否拮抗D-半乳糖等糖类致衰剂诱导AGEs致细胞损伤也值得深入研究。Gangoiti等[20]的研究表明唑来膦酸可能通过阻断AGEs介导的ROS生成对成骨细胞活性影响起正向调节作用。其后续文献[21]发现低浓度（10-8 mol/L）的阿仑膦酸能够逆转AGEs诱导的成骨细胞凋亡和细胞形态改变。本研究结果显示0.01、0.05 μmol/L的唑来膦酸浓度具有拮抗D-半乳糖致成骨细胞损伤的作用（P<0.05）。

综上所述，本研究评估了不同浓度唑来膦酸对成骨细胞活性的影响，初步探讨唑来膦酸对D-半乳糖导致的成骨细胞损伤的拮抗作用。本研究的不足之处在于未在基因、蛋白质组学方面做更进一步的深入研究。有关D-半乳糖诱导AGEs的产生继而通过损伤成骨细胞活性来影响骨形成促成骨质疏松的发展，有着一系列的可能性。这一问题的进一步澄清，以及针对唑来膦酸对于成骨细胞及AGEs作用途径的研究将为唑来膦酸在骨质疏松症临床治疗中的应用提供合理的循证实验依据。

参考文献

[1]中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会.原发性骨质疏松症诊疗指南（2017）[J].中国骨质疏松杂志，2019，25（3）：281-309.

[2] ORYAN A，SAHVIEH S.Effects of bisphosphonates on osteoporosis：Focus on zoledronate[J].Life Sci，2021（264）：118681.

[3] WANG L，FANG D，XU J，et al.Various pathways of zoledronic acid against osteoclasts and bone cancer metastasis：a brief review[J].BMC Cancer，2020，20（1）：1059.

[4]黃晓林，廖健，洪伟，等.破骨细胞形成过程中唑来膦酸的作用途径及机制[J].中国组织工程研究，2019，23（17）：2716-2721.

[5] AZMAN K F，ZAKARIA R.D-Galactose-induced accelerated aging model：an overview[J].Biogerontology，2019，20（6）：763-782.

[6] MOLDOGAZIEVA N T，MOKHOSOEV I M，MELNIKOVA T I，et al.Oxidative stress and advanced lipoxidation and glycation end products（ALEs and AGEs）in aging and age-related diseases[J].Oxid Med Cell Longev，2019，2019：3085756.

[7] REYNAERT N L，GOPAL P，RUTTEN E P A，et al.Advanced glycation end products and their receptor in age-related，non-communicable chronic inflammatory diseases;Overview of clinical evidence and potential contributions to disease[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2016，81（Pt B）：403-418.

[8] AYDIN F，KALAZ E B，KUCUKGERGIN C，et al.Carnosine treatment diminished oxidative stress and glycation products in serum and tissues of D-galactose-treated rats[J].Current Aging Science，2018，11（1）：10-15.

[9] SHWE T，PRATCHAYASAKUL W，CHATTIPAKORN N，et al.

Role of D-galactose-induced brain aging and its potential used for therapeutic interventions[J].Experimental Gerontology，2018，101：13-36.

[10] FOURNET M，BONTE F，DESMOULIERE A.Glycation Damage：A Possible Hub for Major Pathophysiological Disorders and Aging[J].Aging and Disease，2018，9（5）：880-900.

[11] CHEN J，JING J，YU S，SONG M，et al.Advanced glycation endproducts induce apoptosis of endothelial progenitor cells by activating receptor RAGE and NADPH oxidase/JNK signaling axis[J].American Journal of Translational Research，2016，8（5）：2169-2178.

[12] CHEN H，LIU W，WU X，et al.Advanced glycation end products induced IL-6 and VEGF-A production and apoptosis in osteocyte-like MLO-Y4 cells by activating RAGE and ERK1/2，P38 and STAT3 signalling pathways[J].International Immunopharmacology，2017，52：143-149.gzslib202204021642

[13] MENG H Z，ZHANG W L，LIU F，et al.Advanced Glycation End Products Affect Osteoblast Proliferation and Function by Modulating Autophagy Via the Receptor of Advanced Glycation End Products/Raf Protein/Mitogen-activated Protein Kinase/Extracellular Signal-regulated Kinase Kinase/Extracellular Signal-regulated Kinase（RAGE/Raf/MEK/ERK）Pathway[J].Journal of Biological Chemistry，2015，290（47）：28189-28199.

[14] MARUOTTI N，CORRADO A，NEVE A，et al.Bisphosphonates：effects on osteoblast[J].European Journal of Clinical Pharmacology，2012，68（7）：1013-1018.

[15] SCALA R，MAQOUD F，ANGELELLI M，et al.Zoledronic Acid Modulation of TRPV1 Channel Currents in Osteoblast Cell Line and Native Rat and Mouse Bone Marrow-Derived Osteoblasts：Cell Proliferation and Mineralization Effect[J].Cancers（Basel），2019，11（2）：206.

[16] BASSO F G，SILVEIRA TURRIONI A P，HEBLING J，et al.Zoledronic acid inhibits human osteoblast activities[J].Gerontology，2013，59（6）：534-541.

[17] BASSO F G，PANSANI T N，CARDOSO L M，et al.Influence of bisphosphonates on the behavior of osteoblasts seeded onto titanium discs[J].Brazilian Dental Journal，2020，31（3）：304-309.

[18] HUANG X，HUANG S，GUO F，et al.Dose-dependent inhibitory effects of zoledronic acid on osteoblast viability and function in vitro[J].Molecular Medicine Reports，2016，13（1）：613-622.

[19] ACIL Y，ARNDT M L，GULSES A，et al.Cytotoxic and inflammatory effects of alendronate and zolendronate on human osteoblasts，gingival fibroblasts and osteosarcoma cells[J].Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery，2018，46（4）：538-546.

[20] GANGOITI M V，CORTIZO A M，ARNOL V，et al.Opposing effects of bisphosphonates and advanced glycation end-products on osteoblastic cellls[J].European Journal of Pharmacology，2008，600（1-3）：140-147.

[21] GANGOITI M V，ANBINDER P S，CORTIZO A M，et al.

Morphological changes induced by advanced glycation endproducts in osteoblastic cells：effects of co-incubation with alendronate[J].Acta Histochem，2013，115（7）：649-657.