微藻对抗生素的毒性响应及去除作用

李雅琪，秦海天，黄 河

（长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023）

据统计，中国是抗生素产量及用量最多的国家［1］，2013 年在环境中检出的 36 种常用抗生素在中国的总消费约为16.2 万t，约是世界第二大抗生素消费国美国的9 倍［2］。抗生素的使用为现代医疗和规模化禽畜养殖做出了巨大的贡献，但是抗生素的长期大量使用甚至滥用带来的危害不容小觑。低浓度抗生素持续暴露会使很多细菌包括人类病原体在内的致病菌产生抗药性［3，4］，增强某些微生物的免疫力，改变微生物群落的组成和活性［5］。大量细菌产生抗药性将会对人类和现代医学构成一定的威胁［6］，可能使人类走到“无药可医”的地步，因此抗生素污染问题已经引起国际广泛的关注［7］。

水中抗生素来源主要有医院废水、城市生活污水、工业废水和农业废水［8-10］。禽畜粪便作为肥料直接或间接施用于农田，是土壤抗生素的重要来源［8，11］。目前常用的污水处理技术并不能将抗生素有效去除［8，12，13］，导致城市污水处理厂、禽畜养殖场、医院废水出水仍有抗生素残留，甚至残留浓度较高。有一些新型的污水处理技术可用于去除污水中的抗生素［14，15］，但应用成本高、带来的二次污染和有机物矿化等问题限制了其大规模使用。因此，需要一种成本低、污染小、环境友好型的方法来去除污水中的抗生素。

藻是混合营养型生物，可以利用太阳能、空气中的CO2、污水中的营养物质生长繁殖，也可以根据环境中碳源和营养物质的可利用性在自养和异养两种营养模式间转换，大大提高了微藻在极端环境中生存和繁殖的能力，相较于其他生物，藻类克服了在生长繁殖和降解污染物时受碳和营养物质限制的问题。微藻普遍具有繁殖速度快、容易获得的特点［16］，使基于藻类的水处理技术脱颖而出，受到水处理领域的广泛关注［17-22］。藻的生长过程是一个固碳的过程，藻类本身是一种可再生的生物能源，通过光合作用，可将空气中的二氧化碳和水体中的营养物质转化成油脂，其含量可达细胞干重的30%～70%，收获后的藻类可用于生物质能领域［17，21-27］。此外还在化妆品［28-30］、水产养殖［30］、食品饲料［29-33］、医疗保健［28，29，32］等领域也有潜在的应用价值。所以，与传统的污水处理技术相比，基于藻类的水处理技术是环境友好型的，满足可持续发展的要求。

微藻去除废水中的营养元素是近年来研究的热点。氮、磷是组成细胞的重要元素，蛋白质、酶、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）和遗传物质等都含有大量的营养元素，这是藻类利用氮、磷营养元素的基础。藻类去除氮、磷有直接和间接两种方式，直接方式为合成细胞物质，见下式［34］。

从原水中分离出的藻类可以对未经稀释的废水中的无机营养物质达到很好的处理效果，如Wen等［35］从养猪废水中分离出的名为MBFJNU-1 的小球藻，处理废水12 d，TN 和TP 的去除率分别可以达90.51% 和 91.54%；Qu 等［36］用从猪场附近的河流中分离出的Parachlorella kessleriQWY28，在 30 ℃、光照强度为600 μmol/（m2·s）、CO2浓度为2.5%的条件下，对未经稀释、未经灭菌的养猪废水的TN 和TP 去除率分别为95%和接近100%，碳氢化合物的产量达646 mg/（L·d）；程海翔［37］用分离出的栅藻处理未灭菌的养猪废水时，氨氮、总磷的去除率分别为99.2%、54.3%，而且藻细胞总脂含量为12.1%～14.6%，脂肪酸成分中以C16-C18 含量为主，占总脂肪酸含量的70.7%，适合作为生物柴油生产原料；Luo 等［38］在当地池塘分离出Coelastrellasp.QY01，其对养猪废水中的NH3-N、TP 和碳水化合物的去除率分别达100%、100%和78%，油脂产率最高为24.8%。除营养物质外，废水中存在的许多有毒有害污染物都可以用藻类或菌藻体系通过表面吸附、生物积累和沉淀等作用去除，如重金属［21］、抗生素、多溴联苯、激素、农药等［16，39］。

由于抗生素污染的出现和微藻污水处理技术的优点，近几年藻类去除环境中的抗生素已受到人们的关注。本研究对近年来抗生素对藻类的毒性作用、藻类去除抗生素的影响因素及其去除机理等方面的研究进展进行综述，以期对藻类的综合利用提供参考。

1 抗生素对藻类的毒性作用

原核生物起源于半自主性细胞器如叶绿体和线粒体［40］，所以藻类作为真核生物虽然不是抗生素的既定目标，但抗生素仍可以通过抑制叶绿体的新陈代谢，如蛋白质的合成和光合作用，来抑制藻细胞的生长［40，41］。抗生素对藻类的毒性效应主要有以下几种。

1）抑制微藻生长、繁殖。20～80 mg/L 的氧氟沙星会抑制Scenedesmus obliquus细胞的生长，最大降幅为 25.52%［42］。环丙沙星在 40～100 mg/L 时会对Chlamydomonas mexicana的生长产生明显的抑制作用［43］，在 25 mg/L 时会显著抑制Pseudokirchneriella subcapitata的生长［44］。

2）改变藻细胞的结构。细胞结构的完整性是细胞完成生命活动的必要条件，细胞膜在维持细胞内环境的相对稳定、参与外界环境的物质交换和信息传递等方面发挥重要作用。暴露在5 mg/L 的四环素及其降解产物下的小球藻（Chlorella vulgaris）细胞膜的通透性会增大，透射电镜结果显示，细胞会出现不同程度的质壁分离，细胞内淀粉颗粒脱落，细胞质内出现的可能是细胞膜降解产物的絮状物质，还会导致藻细胞核电子密度下降、类囊体、叶绿体缩小变形等。类囊体损伤表明光合酶系统受到影响，能量转换不能顺利进行，光合作用受阻［45］。

3）影响微藻细胞光合色素的合成。许多抗生素是光合作用抑制剂，可以阻断光合酶系统的电子传递链［40］。叶绿素与光能合成密切相关，包括光的采集、能量传递和光能的转换，藻类生长受到抑制往往与有毒化合物影响叶绿素的合成有关［46］。当Chlorella vulgaris暴露于 50 mg/L 的诺氟沙星，第 7 天其叶绿素a 的合成受到明显的抑制［47］；克拉霉素胁迫下，Chlorella vulgaris的细胞色素含量会显著下降［48］；Moro 等［49］也证实了土霉素会导致光合色素数量减少、叶绿体超微结构紊乱。但有报道指出，当用低浓度抗生素处理时，微藻内叶绿素含量反而会增加，只有在高浓度作用下才会减少，呈低浓度促进、高浓度抑制的现象。如当暴露于60 mg/L和100 mg/L的环 丙沙星 11 d 后，Chlamydomonas mexicana的叶绿素含量分别增加了38%和19%［43］；较低浓度的左氟沙星暴露使微囊藻（Microcystis flos-aquae）叶绿素含量显著增加，高浓度作用则会使Microcystis flosaquae的叶绿素含量降低［50］；当暴露于 10 mg/L 的氧氟沙星时，Scenedesmus obliquus的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量会增加，但当氧氟沙星浓度为20～320 mg/L 时，细胞色素含量会显著下降［42］。

4）对微藻造成氧化损伤。植物体内活性氧（ROS）的产生和清除在正常条件下保持着动态平衡，但当环境污染物浓度发生变化时，会产生过量的ROS，包括超氧化物自由基（·O2-）、羟基自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2），对藻细胞造成氧化损伤［43］。藻类有一套完整的抗氧化酶系统，在环境发生变化时，保护藻细胞免受氧化损伤［51］。活性氧（ROS）的去除受酶促抗氧化剂和非酶促抗氧化剂调节。酶促抗氧化剂有过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）-过氧化物酶和抗坏血酸-谷胱甘肽循环中涉及的酶，非酶促抗氧化剂有抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽［40］。SOD 的活性随着环丙沙星浓度的增加而显著增强，当暴露在浓度为60 mg/L 和100 mg/L的环丙沙星11 d 时，SOD 活性最强，分别为对照组的3 倍和 8.5 倍［43］。在红霉素浓度为 0.3 mg/L 时，Pseudokirchneriella subcapitata的总抗坏血酸和总谷胱甘肽的含量降低了47.8%和64.8%，说明红霉素会干扰 AsA 和 GSH 的生物合成［40］，当抗氧化剂的活性或抗氧化反应不足以抵消ROS 的积累时，会对微藻造成氧化损伤［52］。表1 列出了抑制半数藻类生理活性的抗生素浓度。

表1 抗生素对不同微藻的生态毒理学效应

抗生素对藻类和其他水生生物的毒性已被广泛研究［8，10，50］。有研究结果表明，抗菌蛋白合成抑制剂如阿奇霉素、强力霉素、氟苯尼考和土霉素等对藻类有明显的的毒性作用，而细胞壁合成抑制剂如头孢噻肟、阿莫西林等对藻类的毒性作用较低［58］。

2 藻类去除抗生素的影响因素

2.1 藻种及抗生素种类的影响

抗生素的去除率很大程度上与藻种的选择有关。不同的微藻对抗生素的敏感性不同（表1）、去除效率也不同（表2），因此在藻种的选择上，应综合选择对目标抗生素不敏感、耐受性好且降解效果良好的优势藻种。Adrian 等［59］研究了 4 种微藻对 9 种抗生素的降解。结果表明，当目标抗生素为大环内酯类时，Chlamydamonas reinhardtii和Chlorella sorokiniana会有更好的去除效果；而当目标抗生素为磺胺嘧啶时，Chlamydamonas reinhardtii是惟一能生物转化该抗生素的微藻。大多数研究表明β-内酰胺类抗生素对绿藻几乎没有毒性，其对微藻的EC50值大于 1 g/L［56，44］。微藻和浮萍对磺胺甲恶唑、四环素、土霉素的敏感性相差无几，但暴露于氧氟沙星和环丙沙星时，浮萍比绿藻更敏感，氧氟沙星和环丙沙星对Lemna minor的EC50分别为 0.1 mg/L 和 0.7 mg/L［10，57］，而 对Pseudokirchneriella subcapitata的EC50分 别 为1.1 mg/L 和 1.4 mg/L［8，54］。

表2 不同微藻对抗生素的去除率及其去除条件和去除机理

2.2 环境条件的影响

当废水环境发生变化时，微藻对抗生素的去除效果也会发生改变。①营养元素改变。通过添加有机底物或无机物增加碳源可以增加抗生素的去除效率，或外加可以作为电子供体的碳源（NADH 再生的必要条件）与微藻协同代谢非生长所需的底物。如Xiong 等［43］在含环丙沙星的废水中加入了 4 g/L 的醋酸钠，显著提高了Chlamydomonas Mexicana对环丙沙星的去除效率（是纯藻去除的3 倍）；Zhang 等［62］添加NaHCO3可使头孢呋辛钠24 h 的去除率从10.21%提高到92.89%。②水体的含盐量改变。如只有在海水中生长的Dunaliella tertiolecta对氟喹诺酮类抗生素的去除率比无藻组高，原因是盐含量上升会提高抗生素的光解效率［59］；随着废水中盐浓度的增加，Scenedesmus obliquus和Chlorella vulgaris对左氧氟沙星的去除率也在不断增加［51，55］。③pH 的影响。当pH 在4～11 变化时，微藻对头孢菌素抗生素7-ACA 的去除率先上升后下降，但是当 pH 在 7～8 时，去除率未见明显变化，一般来说，当环境适宜微藻生长时有助于抗生素的去除［63］。④抗生素浓度的影响。在氧氟沙星浓度为10 mg/L 时，Scenedesmus obliquus可以将其去除，但当氧氟沙星浓度升高到20～320 mg/L 时，去除效果受到限制［42］。⑤藻生物量的影响。当藻生物量达到一定浓度后，降解率会随着藻生物量的增多而降低，因为过多的藻会挡住光线，出现光屏蔽效应［64］。⑥光照的影响。光照强度会影响藻类的光合作用速率从而影响藻类的生命活动，藻类都有其最适宜的光照强度［65］。此外，光照周期、光源的选择都会对抗生素的降解带来影响。Tian 等［66，67］认为光照可以促进藻类产胞外有机物（EOMs）从而促进抗生素的降解。

3 藻类去除抗生素的过程和机理

3.1 生物吸附

藻细胞中存在纤维素、几丁质、藻酸盐、多糖等多囊物质，且藻可以分泌胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS），胞外聚合物主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成［68］。这些化学成分为重金属和有机污染物的吸附提供了场所［69，70］。藻类可以作为生物吸附剂［71］。吸附效率由抗生素的亲水性能、结构特点和微藻的细胞大小、比表面积和表面性质等来决定［63］。

微藻对抗生素的吸附速度很快，不到10 min 便可以吸附饱和，研究表明，吸附是Chlorellasp. Cha-01、Chlamydomonassp. Tai-03、Mychonastessp. YL-02 去除 7-ACA 的主要途径［63］；可电离药物的吸附比较复杂，带正电荷的药物可以通过静电相互作用吸附在带负电荷的微藻表面［72］。微藻对酸性药物的吸附性一般较弱，尤其是当水的pH 有利于脱质子时［73］，藻类光合作用引起pH 升高会降低对酸性药物的吸附。另外，藻类生物膜中的金属离子可以为两性离子提供吸附位点，增加吸附性，如氟喹诺酮类和四环素类以两性形式存在的抗生素［74，75］。

吸附的过程仅是将抗生素从废水中转移到藻类或者藻-菌表面，而不是分解它们，Chen 等［63］的研究指出，15 min 后，藻类就会解吸7-ACA，所以仅生物吸附处理抗生素仍然会对水环境构成威胁。有研究用海藻酸钠等包埋材料对微藻做适当处理，以避免吸附质的释放，但包埋材料的成本和污染问题仍需考虑。

3.2 生物积累

正辛醇-水分配系数低的污染物（logKow＜5）可以被水生生物吸收和积累，而分配系数高的污染物会分配到细胞的脂质膜中，随食物链被生物放大［76］。抗生素的 logKow普遍小于 5［58，77-80］，因此微藻可以通过吸附、生物积累去除废水中的抗生素。

吸附是细胞外的生物过程，而生物积累是细胞内的一个过程［81］。生物积累是甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲恶唑和强力霉素去除的主要生物途径［80，82］。此过程可以看成生物降解的一个前步骤，生物积累和生物降解结合能有效降解抗生素。如左氧氟沙星先被Chlorella vulgaris积累后由生物降解去除［51］；磺胺甲嘧啶先在Chlorella pyrenoidosa内积累再被降解去除［61］。但不是所有抗生素的去除都会经过这一步骤，磺胺类药物和洛美沙星就不会在试验的4 种藻内积累［77］。生物积累是抗生素穿过细胞膜，然后可能被细胞吸收实现的，并不是所有的微藻积累了抗生素后还会继续降解抗生素。其可能会继续留在微藻细胞内，并通过食物链进一步积累和生物放大，最终对人类带来影响。

3.3 生物降解

微藻可以通过降解将复杂的母体化合物分解成简单的小分子。生物降解是微藻去除污水中有机污染物最有效的途径，其主要反应是酶促反应［16］。所以，相对于吸附、富集和其他非生物因素，生物降解是去除溶解性抗生素的主要机制［77］。

藻类含有代谢多种外源物质的酶，其代谢过程可分为3 个阶段［83］。第一阶段为Ⅰ相代谢，Ⅰ相代谢通过氧化、还原或水解反应，添加极性基团（如羧基、羟基等），使脂溶性外源化合物转化为亲水性的复合物。细胞色素P450 是I 相代谢的主要酶系，是分布在内质网和线粒体内膜上的一类亚铁血红素，参与催化解毒的初级代谢过程［84］。第二阶段为Ⅱ相代谢，是在Ⅰ相代谢的基础上再引入强酸基团，使有毒化合物某些官能团失活，促使化合物水溶性增加，使其更易排出体外。Ⅱ相反应是一种解毒反应。如乙酰基转移酶可以催化芳香胺类物质（苯胺、磺胺等）与来自乙酰辅酶A 的乙酰基结合，形成乙酰化合物；谷胱甘肽-S-转移酶能催化还原性谷胱甘肽（GSH）与一些卤化有机物、环氧化物等结合，降低此类化合物的毒性，对机体起保护作用。Ⅱ相酶偶联可以打开环氧化物的环，以保护氧化损伤［16］。在可以进行光合作用的生物体中，第三阶段为外源物质在液泡或细胞壁部分的分离［85，86］。藻类对外源物质的解毒能力与哺乳动物的肝脏相似，因此藻类被认为是环境污染物解毒的绿色肝脏［83］。

Xiong 等［55］研究表明Scenedesmus obliquus对左氧氟沙星的生物转化主要包括脱羧、侧链断裂、去甲基化和开环；磺胺嘧啶的降解途径有水解、甲基化、氯取代，磺胺甲恶唑的降解过程包括硝化、脱氯、甲基化；大环类脂类生物降解途径为水解、脱水、去甲基化、氯化等［59］；甲砜霉素降解途径有氯取代、氧化反应、脱水、侧链断裂、羟基化［87］。图 1 中列出了微藻降解抗生素时所涉及到的反应，主要包括水解［59］、去甲基化［59］、脱羧反应［55］、脱羟基［55］、开环［55］、羟基化［53］、脱氨基［53］、亚硝化［53］、氯化［87］、氯取代［87］。

图1 微藻用于抗生素生物降解涉及到的反应

应该注意，有的微藻污水处理系统中并不是生物降解占主导作用，有些对光敏感的抗生素，如喹诺酮类（氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星），光解作用更明显，加入藻之后降解效率反而下降，原因可能是藻类产生了光屏蔽效应，阻止了光线的照入［59］。因此在选择研究对象时，应周全考虑所有因素的影响。

4 展望

藻类去除污水中的抗生素还处于探索阶段，未来还需要做很多工作。①藻类去除抗生素的机理，特别是其中间及最终产物的确定及其毒性还有待进一步探究；②藻类去除污水中抗生素的潜力还需要通过应用在实际废水中进行评估；③微藻的收获方式及后续处理或应用，以及其是否还会释放出毒性还需要继续研究。