健脾益气方治疗猴免疫缺陷病毒感染猕猴的实验研究

赵明亮 刘本波 丁雪 孟鹏飞 徐立然 田仁荣 郑永唐

摘要：目的 评价健脾益气方对正常实验猴的影响及治疗SIVmac239感染猕猴慢性期的作用效果。方法 4只正常实验猴及8只SIVmac239病毒感染的实验猴，随机分为正常组、对照组、健脾益气方治疗组3组。检测不同时期健脾益气方对正常实验猴和感染猴的体重、血常规、血生化、血浆病毒载量以及CD4+ T细胞和CD8+ T细胞计数及各亚群的变化情况。结果 健脾益气方对正常实验猴的常规生理指标影响较小，其中白细胞计数和血小板计数与干预开始前相比逐渐降低（P<0.05），但均在非人灵长类动物血常规检测指标的参考范围之内。对照组血小板计数在实验期间显著降低（P<0.05），健脾益气方治疗组也有降低但差异不显著（P>0.05），均在正常参考范围之内。对照组血浆病毒载量与治疗前相比升高了1.01 log10 copies/mL，治疗组升高了1.48 log10 copies/mL，但无显著性差异（P>0.05）。对照组CD4/CD8细胞比值在实验期间逐渐降低（P<0.05），但治疗组无此现象;其中治疗组在治疗8周时CD4/CD8细胞比值明显高于对照组（P<0.05）。治疗组在各治疗时间点CD38+CD4+ T细胞百分比和CD38+CD8+ T细胞百分比均高于对照组，组间无显著性差异（P>0.05），均维持相对稳定。治疗组nave CD4+ T细胞百分比及nave CD8+ T细胞百分比在各治疗时间点均高于对照组，但无显著性差异（P>0.05）。 结论 健脾益气方对正常实验猴的一般生理参数影响较小;对SIVmac239感染实验猴血常规指标影响也较小;对病毒感染慢性期的肾损伤可能有保护作用;对实验猴血浆病毒载量无明显抑制作用;但可提高CD4/CD8细胞比值、CD4+ T细胞和CD8+T细胞活化以及T细胞亚群百分比发挥免疫功能。

关键词：健脾益气方，猴免疫缺陷病毒，猕猴，免疫功能，动物模型

中图分类号：R285.5  ; 文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）03-0071-07

人类免疫缺陷病毒（HIV）是一种包膜逆转录病毒，感染HIV病毒可导致获得性免疫缺陷综合症（AIDS），HIV病毒进入人体后2至4周，患者可能会出现原发感染的相关症状[1]。HIV可分为HIV-1和HIV-2，HIV-1在全球范围内更广泛，毒性更强。HIV病毒结合T淋巴细胞表面的CD4分子和CCR5（趋化因子共受体）受体与细胞膜融合，从而进入辅助T淋巴细胞。在与宿主基因组整合形成HIV原病毒，然后进行转录和病毒mRNA的生产。HIV是在宿主细胞中进行结构蛋白制造和组装，然后从宿主细胞出芽释放病毒粒子感染其他细胞[2]。截至2019年底，全球现存活HIV/AIDS患者约为3800万例[3]。随着HAART治疗的不断推广，艾滋病已经成为可控的慢性传染性疾病，发病率和死亡率大大降低[4-5]。然而，当前HAART治疗仍然存在包括药物副作用、成本收益、治疗依从性、病毒学失败、耐药等方面的问题[6-7]。因此，寻找新方法和有效药物成为目前艾滋病治疗研究的新领域。

健脾益气方是由河南省中药研究院根据中医辨证论治原则针对于艾滋病患者免疫功能低下所研制出的一种提免疫中药制剂[8]。它的功效主要为益气健脾，养血护胃，解毒功效，能增加机体免疫功能[9]。猕猴（Rhesus macaques，RM）感染猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）已被广泛用作HIV/AIDS研究的一个成熟的非人灵长类动物模型。越来越多的研究使中国RM来评估SIV感染的免疫发病机制[10]。本研究采用SIVmac239感染猕猴评价健脾益气方治疗SIV感染猕猴的效果实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及毒株 中国猕猴12只，雄性，体重7.6～9.9 kg，年龄5～6岁，毛色正常，精神状态健康，经检测无SIV，STLV（猴T淋巴细胞病毒），SRV（猴逆转录病毒），BV（细菌性阴道病），CMV（巨细胞病毒）五种病原。实验动物由中国科学院昆明动物研究所灵长类动物中心提供，实验动物饲养环境干净、整洁、无噪音、采光正常、夜晚关灯、给予猴粮及水果饲喂，确保整个饲养环境对实验猴的正常生理活动无不良影响。实验获得中国科学院昆明动物研究所伦理学委员会批准（批准号：IACUC18010）。SIVmac239病毒由本实验室培养保存。

1.2 主要试剂 舒泰50（FeiBo）、小牛血清（gibco）、Ficoll-PaqueTM PREMIUM（GE）、DMSO（SIGMA）、1×PBS、0.9%生理盐水、Fixation and Permeabilization Solution（BD）、10×Lysing Buffer（BD）、BD Trucount Tubes、10×RBC Lysis/Fixation Solution（BD）、CST beads（BD）、Perm/Wash Buffer（BD）、High Pure Viral RNA Kit试剂盒（Roche）、RNA-directTM Realtime PCR Master Mix（Toyobo）、流式抗體APC-Cy7 CD3（SP34-2）、PerCp-cy5.5 CD4（OKT4）、PE-Cy7 CD8（RPA-T8）、APC CD14（M5E2）、FITC CD20（2H7）APC HLA-D（L243）、FITC CD38（AT-1）、PE PD-1（EH12.1）、PE Ki67（B56）、APC CD28（CD28.2）、FITC CD95（DX2）购自美国BD公司。

1.3 主要仪器 电子天平、BC-2800Vet兽用全自动血液细胞分析仪（迈瑞）、Applied Bio systems 7500 Fast Real-Time PCR System定量PCR仪（ABI，美国）、超纯水仪（Millipore）、BDverse流式细胞分析仪（BD）、二级生物安全柜（Thermo Fisher）、常温冰箱（Haier）。

1.4 实验药物 健脾益气方是由河南中医药大学第一附属医院提供，以人参、黄芪、白术、茯苓、当归、川芎、白芍、黄芩等以君臣配伍而成。

1.5 动物分组及处理方法 12只猕猴随机分为正常组、对照组和治疗组（健脾益气方药物用量为1.08 g/kg，相当于临床的等效剂量）3组，每组4只。对照组和治疗组均静脉注射SIVmac239病毒（病毒滴度为1×103 TCID50）建立SIV感染动物模型。感染18周后进行健脾益气方治疗。用电子天平精确称取每只猴所需药粉量，分别将药粉与繁殖饲料按1∶10的比例混合均匀，对照组给予等量繁殖饲料，每日1次，治疗24周。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 血常规检测 采用BC-2800 Vet兽用全自动血液细胞分析仪检测外周血常规指标。

1.6.2 血生化检测 血生化指标检测为ALT、AST、AST/ALT、Cr、GGT、LDH，并委托昆明金域医学检验所有限公司进行检测。

1.6.3 免疫指标检测 采用BDverse流式细胞分析仪检测全血中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞计数、免疫活化及各亚群比率。

1.6.4 血浆病毒载量检测 采集实验猴全血分离血浆，提取血浆中病毒RNA，采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System定量PCR仪检测血浆病毒载量。

1.7 统计学方法 采用统计软件SPSS22.0软件（IBM公司，美国）进行分析。数据描述使用其均数、标准差并以（x±s）表示，2组数据之间的差异采用非参数检验（Mann-Whitney检验），多配对数据的差异采用非参数检验（Friedman检验），P<0.05认为差异显著;流式数据使用FlowJo VX版本进行数据分析。

2 结果

2.1 健脾益气方对正常猴常规生理指标的影响 4只正常猴给药健脾益气方后进行了持续的日常观察，在给药期间正常猴的饮食、毛发、精神状态、排泄物以及活动能力均维持正常状态。检测了在健脾益气方给药前、给药8、16、24周正常猴的体重、6项血常规指标及6项血生化指标;其中体重、淋巴细胞计数、淋巴细胞比率、红细胞计数、血红蛋白、谷草转氨酶、谷草转氨酶/谷丙转氨酶、肌酐、γ-谷氨酰转肽酶及乳酸脱氢酶在研究期间均未呈现出显著性变化（P>0.05）。白细胞计数和血小板计数与给药前相比逐渐降低（P<0.05），但均在非人灵长类动物血常规检测指标的参考范围之内。谷丙转氨酶在干预24周时升高（P<0.05）（表1）。其中4只动物中的1只动物谷丙转氨酶检测值较高，同时健脾益气方对正常猴也未显示出过敏症状。综上可知，研究结果表明健脾益氣方的安全性较好。

2.2 健脾益气方对SIVmac239感染猕猴体重及血液常规参数的影响 两个实验组在治疗前和治疗后4、8、16、24周体重及血常规参数：两个实验组的体重、白细胞、淋巴细胞计数、淋巴细胞比率、红细胞计数及血红蛋白在组内各时间点之间没有显著差异（P>0.05）。对照组血小板计数在实验期间显著降低（P<0.05），治疗组也有降低但差异不显著（P>0.05），均在正常参考范围之内。两个实验组在相同时间点的体重、白细胞、淋巴细胞计数、淋巴细胞比率、红细胞计数、血红蛋白及血小板组间没有显著差异（P>0.05）（表2）。研究表明健脾益气方对SIVmac239感染实验猴血常规指标影响较小。

2.3 健脾益气方对SIVmac239感染猕猴血生化参数的影响 两个实验组在治疗前和治疗后4、8、16、24周血生化参数：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷草转氨酶/谷丙转氨酶及γ-谷氨酰转肽酶在组内各时间点之间没有显著差异（P>0.05）。对照组肌酐在组内各时间点逐渐升高（P<0.05），但治疗组无此现象;对照组和治疗组乳酸脱氢酶均在组内逐渐降低（P<0.05），临床诊断肌酐升高说明肾功能出现了损伤，乳酸脱氢酶降低没有临床意义。两个实验组在相同时间点的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷草转氨酶/谷丙转氨酶、肌酐及乳酸脱氢酶组间没有显著差异（P>0.05），γ-谷氨酰转肽酶在治疗16周时低于对照组（P<0.05）（表3）。表明健脾益气方对SIVmac239感染实验猴慢性期的肾损伤可能有保护作用。

2.4 健脾益气方对SIVmac239感染猕猴外周血中病毒载量的影响 两个实验组的血浆病毒载量在实验期间组间和组内均无显著性差异（P>0.05），基本保持稳定并略有升高。对照组与治疗前相比升高了1.01 log10 copies/mL，治疗组升高了1.48 log10 copies/mL，但无显著性差异（P>0.05）。表明健脾益气方对实验猴的血浆病毒载量无抑制作用，但可能会起到稳定病毒载量的作用。见表4。

2.5 健脾益气方对SIVmac239感染猕猴外周血中免疫细胞的影响 两个实验组的CD4+ T细胞计数和CD8+ T细胞计数在实验期间组间均无显著性差异（P>0.05），其中CD8+ T细胞计数在治疗8周时治疗组明显低于感染组（P<0.05）;对照组CD4/CD8细胞比值在实验期间逐渐降低（P<0.05），但治疗组无此现象;其中治疗组在治疗8周时CD4/CD8细胞比值明显高于对照组（P<0.05）;治疗组在各治疗时间点CD38+CD4+ T细胞百分比均高于对照组，组间无显著性差异（P>0.05），均维持相对稳定;治疗组CD38+CD8+ T细胞百分比在治疗16周时与治疗前相比升高了17.57，同时治疗组在各治疗时间点CD38+CD8+ T细胞百分比均高于对照组，组间无显著性差异（P>0.05），对照组CD38+CD8+ T细胞百分比组内无差异（P>0.05）;治疗组nave CD4+ T细胞百分比及nave CD8+ T细胞百分比在各治疗时间点均高于对照组，但无显著性差异（P>0.05），详见表5。实验结果表明健脾益气方可提高CD4/CD8细胞比值、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞活化以及T细胞亚群的百分比发挥免疫功能。

3 讨论

艾滋病在中医基础理论的范畴中，可归于中医“疫病”“伏气温病”“虚劳”等，是长期虚劳内损，艾滋病病毒侵袭机体造成正气虚弱，元气损耗，致使免疫系统受损，逐渐发展为艾滋病[9-11]。目前在中医药艾滋病防治领域，单味中药的有效成分及中药复方在艾滋病防治方面也有越来越多的应用。唐草片是中国首个批准用于治疗艾滋病的中成药[12]，在临床中使用的其它中药主要还有艾可清胶囊[13]、太芪培元颗粒[14]、益艾康胶囊[15]、艾灵颗粒[16]、康爱保生丸[17]等，临床研究发现很多复方药物都能够提高患者的免疫力，改善患者的临床症状，对艾滋病患者具有一定的临床疗效[11]。

临床研究表明益艾康胶囊可明显提高HIV感染者CD3+T、CD4+ T淋巴细胞计数，可能与延缓病毒在CD4+ T淋巴细胞内复制以及促进T细胞增殖相关[18]，同时能有效减缓无症状期HIV感染者CD4+ T淋巴细胞亚群的减少[19]。益艾康含药血清还能能显著促进NK-92MI细胞增殖，增强NK-92MI细胞毒功能[20]。本研究首次应用非人灵长类艾滋病动物模型，探究健脾益气方对正常实验猴、SIV感染猴的常规生理指标，抗病毒作用以及免疫功能等方面的影响并进行评价研究。研究结果表明健脾益气方对正常实验猴的常规生理指标影响较小，对SIVmac239感染实验猴慢性期的肾损伤可能有保护作用，但对实验猴血浆病毒载量无抑制作用，同时可提高CD4/CD8细胞比值、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞活化以及细胞亚群的比率发挥免疫功能。

虽然中药治疗艾滋病具有一定的临床疗效，但目前针对艾滋病的治疗依然是以抗逆转录病毒药物为主，但抗逆转录病毒药物也存在毒副作用、耐药、合并用药以及经济成本等问题。有研究表明中药与抗逆转录病毒药物联合治疗可降低抗逆转录病毒药物的副作用，增强机体免疫功能，促进抗逆转录病毒药物疗效[21-28]。因此，可结合中药与抗逆转录病毒药物对艾滋病患者进行联合治疗，在抗病毒的同时恢复机体免疫功能，并减轻抗逆转录病毒药物的副作用，使患者的依从性得以提高，促进治疗效果。根据患者体征的异同，可用不同的中西医诊疗方案，对艾滋病进行精准医疗，提高艾滋病患者的存活率及生活质量。此外应建立合适的中西药联合治疗艾滋病动物模型，以评价中西药临床前疗效，为临床运用中西药联合治疗艾滋病提供数据参考。总体而言，中西药具有潜在治疗或辅助治疗艾滋病的优势并在未来具有广阔前景。

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（收稿日期：2021-09-01）