不同产地竹节参中7种皂苷含量测定及化学计量学评价

张思敏 张 也 伍红年，3 刘隆基 申佩瑶 严建业 杨 磊

(1. 湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；2. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；3. 浏阳市人民医院，湖南 长沙 410399；4. 中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004)

竹节参(PanaxjaponicusC.A.Mey.)为五加科人参属植物，以干燥根茎入药，也具有较高的食用价值。云南独龙族将竹节参与鲜肉、鸡蛋一同煎煮作为药膳，用于病后补虚及改善虚劳咳嗽等症状[1]；在土家族居住区，人们用其泡酒服用[2]。竹节参主要化学成分为皂苷、多糖、氨基酸以及挥发油[3-4]等。研究表明，竹节参皂苷具有抗溃疡[5]、抗肿瘤[6]、抗脑缺血损伤[7]、保护心脏[8]、保肝[9]、降血脂[10-11]及抗炎镇痛[12-14]等功效。其保健功效也被挖掘，如降血脂、降血糖[3]的药理作用可用于预防“三高”；抗氧化[15]的药理作用可用于延缓衰老；竹节参皂苷Ⅳa对脂肪细胞分化有明显的抑制作用可用于减肥，有望成为减肥产品的功能性食品原料[16]。但由于对竹节参过度挖掘，导致其野生资源锐减。又因人工栽培技术不成熟，产品质量参差不齐，限制了竹节参的应用。为更好推进竹节参在临床和生活中广泛使用，加强对其指标性成分的质量控制至关重要。

《中国药典》2020版采用HPLC法测定其中的人参皂苷Ro(竹节参皂苷Ⅴ)和竹节参皂苷Ⅳ来控制质量，而这两个成分的定量不能较全面地控制竹节参药材质量。目前研究植物中功能性成分定量分析的方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、超高效液相色谱法(UPLC)等[17-19]。由于UPLC法具有灵敏度、分辨率以及柱效好，分离效率高，消耗溶剂少等特点[20]，而且未见采用UPLC法同时测定竹节参中的7种皂苷类成分的相关报道。

研究拟建立测定竹节参中7种皂苷类成分含量的UPLC法，并采用聚类分析、主成分分析与质量波动分析等化学计量学手段进行综合评价，以期为竹节参的质量综合评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

9批竹节参样品(详细信息见表1)：经湖南中医药大学龚力民副教授鉴定为五加科人参属植物竹节参PanaxjaponicasC.A.Mey的干燥根茎；

表1 样品信息Table 1 Sample information

人参皂苷Rg1(批号wkq15121303)、人参皂苷Re(批号wkq16081605)、人参皂苷Rb1(批号wkq16060402)：质量分数≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司；

竹节参皂苷Ⅴ(批号HG027158198)、竹节参皂苷Ⅳ(批号HA305950198)、竹节参皂苷Ⅳa(批号HC027157198)：质量分数≥98%，宝鸡市辰光生物科技有限公司；

假人参皂苷RT1(批号170726)：质量分数≥98%，成都普菲生物技术有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，德国默克股份有限公司；

试验用水均为超纯水；

其他均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY UPLC型，美国Waters公司；

超纯水仪：Option R7 utra AN型，英国ELGA LabWaters公司；

数控超声波清洗器：KQ-5200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混合对照品溶液的制备 参考文献[21]。分别精密称定人参皂苷Rg1、Re、Rb1、竹节参皂苷Ⅴ、Ⅳ、Ⅳa与假人参皂苷RT1各对照品适量，分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到含人参皂苷Rg1(100 μg/mL)、Re(68 μg/mL)、Rb1(102 μg/mL)、竹节参皂苷Ⅴ(1 500 μg/mL)、Ⅳ(700 μg/mL)、Ⅳa(800 μg/mL)，假人参皂苷RT1(440 μg/mL)的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 将不同来源竹节参药材制成粉末状，精密称取过40目筛的各批次粉末1.0 g，置于锥形瓶中，加70%的甲醇50 mL，称重，加热回流提取1 h，冷却至室温，再次称重，并用70%的甲醇补足失重，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

1.2.3 色谱条件 采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱；流动相为水(A)—乙腈(B)，梯度洗脱，0.0～3.5 min，79.0% A；3.5～6.0 min，79.0%～74.0% A；6.0～6.5 min，74.0%～66.3% A，6.5～13.0 min，66.3%～65.0% A，13.0～14.0 min，65.0%～79.0% A；流速0.4 mL/min；检测波长203 nm；柱温30 ℃；进样量1 μL。

1.2.4 方法学考察

(1)专属性试验：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1 μL，按1.2.3的条件进行测定。

(2)线性关系考察：参照文献[21]。

(3)精密度、稳定性及重复性试验：参照文献[21]。

(4)加样回收试验：精密称取已知含量供试品(S6)0.5 g，加入适量各对照品，精密称定。

1.2.5 含量测定 分别取不同产地的竹节参样品，按1.2.2的方法制备样品溶液，按1.2.3的条件进样检测，计算各皂苷成分的含量。

1.2.6 化学计量学分析

(1)聚类分析：以S1～S9样品中7个成分含量为变量，采用组间联接，并选择“平方Euclidean 距离”法进行聚类分析。

(2)主成分分析：对来自不同产地竹节参7种皂苷类成分的含量标准化处理后，对处理结果进行主成分(PCA)分析。

(3)质量波动分析：为探究竹节参样品间的质量，参照文献[22—23]引入参数P值，对各产地竹节参药材质量进行评价，按式(1)计算质量波动值。

(1)

式中：

P——质量波动值；

Ci——给定化合物的含量，μg/mL；

1.2.7 数据分析 运用SPSS 22.0数理统计软件，进行聚类分析和主成分分析；运用Origin 2019进行质量波动分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性试验 由图1可知，供试品溶液的色谱峰与混合对照品的呈现出相同保留时间，此外，在空白对照色谱图中对应位置处无色谱峰，表明该方法专属性良好。

2.1.2 线性关系的考察 将混合对照品溶液配制为系列质量浓度，按1.2.3的条件进样分析，对7种皂苷类成分进行线性关系考察，结果见表2。由表2可知，竹节参各皂苷成分在相应的质量浓度范围内线性关系良好。

表2 7种指标成分的回归方程及线性范围Table 2 Regression equation and linear range of seven index components

2.1.3 精密度试验 取S6样品，按1.2.2的方法制备供试品溶液，按1.2.3的条件重复进样6次，测得竹节参各皂苷成分的色谱峰峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.20%，0.34%，1.34%，0.59%，0.49%，0.47%，1.20%，表明仪器的精密度结果良好。

2.1.4 稳定性试验 取S6样品，按1.2.2的方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h按1.2.3项下的色谱条件进样测定，测得竹节参中各皂苷成分色谱峰峰面积的RSD依次为1.57%，1.23%，2.67%，1.26%，2.05%，2.05%，1.88%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.5 重复性试验 取S6样品，按1.2.2的方法平行制备6份供试品溶液，按1.2.3的条件进样分析，测得竹节参中各皂苷成分色谱峰峰面积的RSD依次为0.23%，0.40%，2.85%，0.23%，0.31%，0.33%，0.27%，表明方法重复性良好。

2.1.6 加样回收试验 精密称取S6样品0.5 g，加入适量各对照品，精密称定。按1.2.2的方法制备供试品溶液，进样测定。由表3可知，各皂苷平均回收率均在95%～105%，相对标准偏差(RSD)均小于3%，表明该方法的回收率良好。

表3 7种指标成分的加样回收试验Table 3 Spike-and-recovery experience of seven index components (n=5) %

1.人参皂苷Rg1 2.人参皂苷Re 3.人参皂苷Rb1 4.竹节参皂苷Ⅴ 5.假人参皂苷RT1 6.竹节参皂苷Ⅳ 7.竹节参皂苷Ⅳa图1 混合对照品溶液、竹节参样品溶液及空白的HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference solution,sample solution of Panax japonicus and blank

2.2 样品含量测定

经测定，各批次竹节参中各皂苷成分含量结果见表4。为充分展示各批次竹节参中7种成分含量的分布特征，以测得的含量结果作雷达图，见图2。由于各批次各成分含量相差很大，作图时，对各成分含量进行修正，使各成分含量乘以修正系数，各系数定：竹节参皂苷Ⅴ为1，人参人参皂苷Rg1为15，人参皂苷Re为30，人参皂苷Rb1为15，人参皂苷RT1为10，竹节参皂苷Ⅳ为2，竹节参皂苷Ⅳa为3。由表4可知，竹节参皂苷V在各批次竹节参样品中含量较高，其次是竹节参皂苷Ⅳ、Ⅳa；人参皂苷Rb1与假人参皂苷RT1在S6中含量较其他样品高。由图2可知，S6、S7与S8的整体轮廓图相对较大，由于这3个批次中的假人参皂苷RT1含量相对较高，特别是S6的轮廓图形与其他各批次的轮廓图差异性较大，由于S6中的7个成分含量均较高；而其他批次的竹节参的整体轮廓图相似，表明其他批次各成分含量更为均匀。

图2 不同批次竹节参样品7种皂苷含量的雷达图Figure 2 Radar images of seven saponins in different batches of Panax japonicus samples

表4 不同批次竹节参样品皂苷含量测定平均结果Table 4 Determination average results of different batches of Panax japonicus samples (n=3) mg/g

《中国药典》2020版规定，竹节参皂苷Ⅴ(人参皂苷Ro)与竹节参皂苷Ⅳa含量≥1.5%。由含量测定结果可知，试验9批不同产地竹节参样品中，竹节参皂苷Ⅴ含量为42.91～97.16 mg/g，竹节参皂苷Ⅳa含量为15.76～32.66 mg/g，均明显高于药典标准，并且这两个成分在9个批次样品中的质量波动较小。但某些成分在不同产地间含量波动较大，说明产地是造成竹节参质量差异的原因之一。

2.3 化学计量学分析

2.3.1 聚类分析 对各批次样品的含量测定结果进行聚类分析见图3。由图3可知，当距离介于15～20时主要聚为3类，其中，四川雅安(S7)、四川乐安(S8)以及湖北神农架(S3)为Ⅰ类；湖北恩施(S1)、湖南石门(S4)、江西吉安(S5)、贵州贵阳(S2)以及云南丽江(S9)为Ⅱ类；四川大凉山(S6)为Ⅲ类。

图3 竹节参样品聚类分析树状图Figure 3 Cluster analysis tree of Panax japonicus samples

2.3.2 主成分分析 为进一步探讨竹节参不同产地间的差异，采用主成分分析进行评价，结果见表5。由表5可得，前3个因子累计贡献率为90.635。由图4可知，前3个成分特征值下降较快，因此折线较为陡峭，其余成分特征值变化较为平缓。取特征值>1的成分作图，结果见图5。由图5可知，9批样品可分为3类，S6为Ⅰ类，S7、S8、S3为Ⅱ类，S1、S2、S4、S5、S9为Ⅲ类，与聚类分析结果一致。

图4 不同产地竹节参主成分分析碎石图Figure 4 Detritus diagram of principal component analysis of Panax japonicus from different habitats

图5 不同产地竹节参主成分分析二维图Figure 5 Two-dimensional principal component analysis of Panax japonicus in different regions

表5 主成分初始特征值和贡献率Table 5 Initial eigenvalue and contribution rate of principal components

综合聚类分析和主成分分析并观察各成分含量可发现，四川大凉山样品中人参皂苷Rg1与假人参皂苷RT1含量明显高于其他批次，提示这可能是造成差异的原因之一。其次，竹节参大多生于高山灌丛阴湿地或岩石沟涧旁，地理位置与生长环境也是导致竹节参药材批次间分类的原因。

2.3.3 质量波动分析 当参数P值越靠近1时，各批间样品一致性越好。一般而言，当P值在0.75～1.25范围内表明该成分的质量波动较小，P值过大或过小表明该成分质量波动较大，是竹节参样品质量波动的重要体现。由图6可知，人参皂苷Rg1、Rb1以及假人参皂苷RT1超出此范围较多，特别是人参皂苷Rg1与假人参皂苷RT1波动范围较大。结合表2、聚类分析及主成分分析可知，人参皂苷Rg1、Rb1与假人参皂苷RT1均在样品S6中含量较高，含量波动较大，因此S6被单独分为一类，与聚类分析及主成分分析结果相呼应。人参皂苷Re及竹节参皂苷Ⅴ、Ⅳ的P值基本在0.75～1.25，表明这几个成分对竹节参的质量波动影响不大。

图6 竹节参样品7个成分的Box-chart图Figure 6 Box-chart plot of seven components of Panax japonicus sample

3 结论

建立了采用UPLC同时测定竹节参药材中7种皂苷类成分含量的方法，该法柱效高，出峰快，耗能少；并结合化学计量学中的聚类分析、主成分分析与质量波动分析对竹节参药材质量的优劣进行了评价。研究结果表明，不同产地的竹节参药材各皂苷类成分含量均有较大的差异。竹节参皂苷V、竹节参皂苷Ⅳ以及竹节参皂苷Ⅳa 3种皂苷在各批次竹节参药材中含量较高，其中竹节参皂苷V>竹节参皂苷Ⅳ>竹节参皂苷Ⅳa；人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1与假人参皂苷RT1含量则较低，特别是竹节参皂苷V与竹节参皂苷Ⅳ均高于药典标准。竹节参中含有丰富的化学成分，试验仅对竹节参药材中7种皂苷成分含量测定进行了研究，若要全面评价竹节参药材质量还可以对竹节参中更多的成分及活性进行系统研究。