阈值下微脉冲激光在糖尿病黄斑水肿中机制及应用的研究进展

赵芳 杨兰 韩媛 何玉枚

糖尿病性黄斑水肿((diabetic macular edema，DME)是导致糖尿病患者视力严重损伤的常见原因，通常表现为视力下降、视物变形、视野缺损等，严重影响患者正常的生活。除了常规的传统格栅样激光及玻璃腔内注药术外，阈值下微脉冲激光也可应用于DME的治疗中。微脉冲激光的特点是：高频、短促、重复，并且选择性地作用于RPE细胞，对其它结构不造成损伤，达到其治疗效应[1，2]，与传统激光相比，安全性较高。每个脉冲通常为100～300 μs，每个脉冲之间有1700～1900 μs的间歇，使视网膜组织在长间歇中驱散积聚的热量，从而避免细胞的凋亡[3]。微脉冲激光在RPE细胞中转换及吸收的效果更佳，更易吸收黑色素及氧化血红蛋白，在低能量的情况下便可起到治疗作用，故更适合于黄斑区疾病的光凝治疗[4]。现对微脉冲激光治疗DME的可能机制、安全性及实际应用情况做一综述。

一、作用机制

目前该机制尚未完全明确，研究显示可能是通过改变视网膜细胞的代谢活性，进而改变基因和蛋白的表达。

(一)减轻视网膜胶质细胞(retinal glial cells,RGC)的代谢活性

RGC的稳态是调节视网膜血流、水平衡和维持屏障功能的前提条件[5，6]，在DR患者中，血管炎症的最初表现就是RGC的激活，RGC是整个炎症过程中的重要参与者。RGC主要包括小胶质细胞(m glial cells,MGC)、Müller细胞和星形胶质细胞，这些细胞在维持视网膜环境的稳态方面起到重要的作用。微脉冲激光可以通过减轻RGC的代谢活性诱导视网膜炎性过程的下调来维护屏障功能以及水平衡。

1.Müller细胞 是连接于视网膜血管与神经元的细胞，主要维持水与K+的稳态，所以当Müller细胞出现功能障碍时便会造成液体的积聚，即黄斑水肿[7]。Midena等[8]发现微脉冲激光治疗后，患者视网膜内核层的厚度变薄，而Müller细胞主要分布在内核层，故得出提示微脉冲可改善DME患者的Müller细胞的功能从而减轻DME症状。但并未有明确的证据。

2.降低胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达 在DR患者视网膜Müller细胞中GFAP的水平含量比较低，甚至不存在，而当GFAP表达增多时，象征着Müller细胞被激活[9]。相关研究显示，血视网膜屏障(blood retinal barrier,BRB)发生破坏的这一过程与GFAP的表达增多相关[10]。综上，我们推测，微脉冲激光可能通过使Müller细胞中GFAP的表达降低，进而使BRB的破坏减轻，渗出水肿减少。

3.恢复Kir 4.1的分布 Kir 4.1属于跨膜蛋白的一种，可调节细胞外K+浓度，从而稳定内环境。其主要定位于视网膜神经上皮层，而该特殊定位决定了调节K+浓度的准确性[11，12]。对于DR患者，Kir 4.1在Müller细胞中发生定位错误，失误活性，减少细胞外K+浓度，从而Müller细胞水肿[13]，微脉冲激光治疗可减轻黄斑区水肿可能与通过恢复Kir 4.1的正确定位有关。

4.调节Müller细胞源性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(MCD-VEGF)的表达 在视网膜的各个结构中，Müller细胞与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞释放VEGF最多[14]。但相关研究报道，在糖尿病模型小鼠的视网膜中，Müller细胞分泌VEGF的量最高[15]。RPE细胞间的紧密连接离不开紧密连接蛋白-1(ZO-1)的作用[16]，另有研究证实，糖尿病模型小鼠的ZO-1逐渐被消耗掉，而这与MCD-VEGF相关[17]。有研究报道[18]，微脉冲激光治疗的DME患者VEGF较之前明显降低，尽管不清楚此处VEGF的源头。Rodrigues等[19]研究表明，MCD-VEGF可促进Müller细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2的表达，并促使其活性增强，而MMP可促进毛细血管的渗漏，从而促进视网膜的水肿，微脉冲激光可能通过下调VEGF的表达而影响MMP-2的表达。

(二)对RPE细胞的刺激作用

当RPE细胞屏障功能发生破坏时，血管出现渗漏，进而导致DME。RPE细胞在具备屏障功能的同时，还可分泌VEGF、色素上皮衍生因子(pigrnent epithelium-derived factor,PEDF)、促血红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等多种生长因子[20]。此外，还具有抗氧化、迁移分化等功能。目前普遍认为微脉冲激光是通过刺激RPE细胞，使之在重复的、短促的阈值下能量的刺激下被激活，开启自我修复调节模式，从而促使水肿消退。但该过程的分子机制目前并不是非常明确，可能机制如下。

1.促进RPE细胞的增生与迁移 Tababat-Khani等[21]研究发现，对DME患者进行微脉冲激光治疗，1 h之后患者视网膜RPE细胞的增生能力下降，而在24 h内即恢复正常，接下来的几天内明显提升，被直接照射及周边附近的细胞均有该特点。也有研究报道[22]被微脉冲激光直接照射的RPE细胞较未被照射的部位数量少，但都具有细胞活性。因此推测，该治疗方式可能损伤了RPE细胞，但是这种程度的损伤可能刺激了照射部位及附近的RPE细胞并促进了增生与迁移。

2.促进RPE细胞间紧密连接的恢复 Ji Cho[23]表明，在DME患者中，VEGF可促使ZO-1磷酸化，ZO-1磷酸化可上调Ⅳ型胶原蛋白的表达，从而可破坏RPE细胞屏障的完整性，而微脉冲激光是否可以直接修复ZO-1，目前不得而知，但是微脉冲激光可以抑制VEGF的表达，从而使ZO-1的损坏降低。

3.抗血管生成 视网膜脉络膜细胞之间正常生理功能的维持离不开抗血管生成因子(如PEDF)与促血管生成因子(如VEGF)的动态平衡。在DME患者中，长期的高血糖状态严重破坏色素上皮细胞间的紧密性，打破PEDF和VEGF的平衡，增强血管的通透性，进而加重黄斑水肿。有研究显示[24]对实验小鼠的RPE细胞进行微脉冲照射之后，抗血管生长因子如PEDF等表达上升，促血管生长因子如VEGF等表达下降，促进两者之间的动态平衡，从而减轻黄斑水肿。

4.影响EPO的分泌 EPO是一类可以促使RPE通透性降低的糖蛋白，此外，EPO可通过阻止ZO-1的磷酸化，维持RPE细胞的屏障功能，从而对视网膜具有保护作用[25]，被认为是RPE细胞的特殊标志物[26，27]。Midena等[27]研究显示，微脉冲激光治疗之后EPO的水平并未发生明显改变，可能与样本量及观察时间有关。另有研究显示，EPO在DME患者的早期可保护视神经，但是到晚期却会促进生成新生血管[28]。所以，有关微脉冲治疗之后EPO的改变及对疾病的影响需要进一步探讨。

5.上调热休克蛋白(heat shock protein,HSP)的表达 HSP在细胞的应激反应中表达比较广泛，在细胞未完全破坏死亡时，可有效修复细胞的功能，帮助变性的蛋白复活。Inagaki等[29]研究显示，微脉冲激光直接照射培养的RPE细胞，达到一定的时间时，细胞中的HSP70在mRNA和蛋白质水平上的表达增加，从而促进受损的RPE细胞修复，减轻炎症反应，降低黄斑水肿。但是在人活体中是否完全一致尚未明确。

二、安全性

微脉冲激光的特征是激活细胞自身的生物修复功能，同时又不损坏RPE细胞。微脉冲激光的能量设置比较精准，作用于RPE层的同时却又不会造成严重损害，一般不会损伤视网膜其它组织，不会产生肉眼可见的激光斑。可以通过进行相干光层析成像术(optical coherence tomography,OCT)检查来观察椭圆体带、嵌合带、RPE层的结构完整性，以此判断是否操作正确。较传统激光有明显安全性优势，目前除因操作失误造成的损害之外很少发现并发症[30]。但不可因此便掉以轻心，在黄斑区的能量错误使用及重复治疗均要谨慎以免造成不可逆损伤。目前大部分医生在操作时会尽量避开中心小凹。

三、不同波长的阈值下微脉冲激光的差异

不同的色素对不同波长的光的吸收各不相同，血红蛋白不吸收红、红外光，吸收绿、黄、蓝光；叶黄素不吸收黄、红、红外光，对蓝光吸收较多，绿光吸收较少；黑素色对蓝、绿光吸收较多，黄、红光吸收较少。此外，光的散射会随波长变短而增多，造成的损害就会越大。532 nm激光波长属于绿光，血红蛋白可在该激光到达RPE层时将其吸收，所以，适用于眼底出血及血管性疾病方面的治疗。577 nm波长属于黄光，黄斑区网膜叶黄素的含量较高，对黄光的吸收率极低，而且黄光的穿透力较强，散射较小，毒性较低，故黄斑区域的病变较适合使用该激光。此外，黄光毒性低，散射小，且穿透力较绿光强。810 nm激光的波长接近红外光谱，穿透性较好，可直达RPE层及脉络膜，更适合运用于脉络膜血管相关的疾病[31]。

四、方法及参数选择

开始治疗前，首先测定阈能量。将微脉冲激光仪器模式调整为连续波，曝光时间：0.05～0.20 s，光斑直径：100～200 μm。选择在后极部正常视网膜(血管弓以外)测定阈能量，能量从100 mW开始，逐渐增加(可10 mW增量)至隐约可见该处视网膜颜色发白，这时的能量设置为阈能量P值，之后将机器模式调整为微脉冲，选择负载系数的5%～30%，阈能量P值的20%～30%，余设置不变，在需要治疗的病变处和周围施行微脉冲激光光凝治疗[32]。Luttrull等[33]研究显示当选择负载系数的5%时，缩小光斑的直径，可以使能量的扩散达到最大化，堆积的热量至最小化。将模式调整为高密度时，可提高疗效。Desmettre[34]发现参数设置为30%的阈能量P值时，通过荧光素眼底血管造影(fundus fluroresein angiogrpahy,FFA)检查并未发现视网膜组织的损伤；若继续增加能量，便可出现组织损伤的现象。需要特别注意的是，微脉冲激光光凝治疗参数目前尚未标准化，参数的设置因人因病而异，过高过低均不合适(过高伤及组织，过低作用不佳)。尽管目前有诸多经验，但微脉冲激光治疗的参数设置仍未标准化，如何最大化提高疗效并降低损伤需要继续研究。

五、在DME中的应用

在DME的治疗方案中，Friberg等[35]于1997年第一次使用了微脉冲激光，在之后的研究中显示[36]，与传统格栅激光光凝相比，微脉冲激光在DME的治疗中的确存在疗效优势。Vujosevic等[37]表示微脉冲激光在中度DME患者的治疗中能保持稳定的视功能。Venkatesh等[38]表示，微脉冲激光较传统激光更好地维持了电生理的检查指标，并提高了患眼的对比敏感度。Inagaki等[39]发现微脉冲激光能有效降低DME水肿并保持稳定的视力。Moisseiev等[40]在相关研究中得出结论：微脉冲激光联合抗VEGF眼内注药可有效缩减注药次数，减轻手术风险及患者经济压力。在如何更好地与抗VEGF药物联合方面也有学者做了详细的研究。Citirik[41]表示当患者黄斑中心凹厚度(CMT)<300 μm时选择微脉冲激光治疗效果更理想，而当CMT>400 μm或者视力很差时则首选玻璃体腔内注射抗VEGF制剂，或者选择二者联合治疗。Moisseiev等[40]、Mansouri等[42]指出，当CMT<400 μm或者最佳矫正视力较好时，即针对轻中度DME患者，选择微脉冲激光治疗，半年之后若无改善，则应进行抗VEGF药物治疗。Lavinsky[43]发现微脉冲激光模式选择方面，高密度比普通模式更有利于功能的恢复。随着这一技术的广泛应用，国内学者[44]也做了相关研究，结论与上述相符。所以，在DME的治疗中，大多数医生认为，单纯微脉冲激光适用于轻中度DME的治疗，而重度DME则需要进行抗VEGF或两种治疗方式联合，以便达到更好的治疗效果。