基于外周血循环和粪便样本进行DNA甲基化技术在结直肠癌早筛中的应用价值探讨*

李为杞 李宝龙

1 广东省广州市从化区妇幼保健院外科 510900 2 南方医科大学第五附属医院普通外科

结直肠癌在临床中较常见，而且由于我国居民饮食发生明显改变，导致其发病率越来越高，存在较高的死亡率。因此，对患者实施早期筛查诊断，可使患者得到早期治疗，对提高患者生存率具有重要意义[1]。结直肠癌发病早期，其表观修饰发生变化，可使基因突变节奏明显增快，因而对表观修复进行检测，可使结直肠癌得到一定筛查[2]。DNA甲基化可使基因表达得到有效调控，健康机体中，全基因组往往呈现为低甲基化表型，当机体出现异常变化时，往往都按照甲基化模式酶发生明显改变，尤其是癌变后，会使此酶出现明显调节时空现象，从而使之基因表达出现异常[3]。本研究选取结直肠癌患者40例，探讨外周血循环和粪便样本进行DNA甲基化技术的应用效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年4月—2020年5月20例正常人群，设定为健康组。纳入标准：患者健康体检未出现肿瘤症状；均知情同意。排除标准：精神分裂症；妊娠期、哺乳期。其中男12例，女8例；年龄35～65岁，平均年龄(52.95±2.58)岁。并选取同时期腺瘤患者20例，设定为腺瘤组，纳入标准：均确诊为腺瘤病变；患者均知情同意。排除标准：其他肿瘤病变；妊娠期、哺乳期；严重精神障碍。其中男11例，女9例；年龄36～66岁，平均年龄(53.02±2.60)岁。选取同时期结直肠癌患者40例，纳入标准：均确诊为结直肠癌；患者知情同意。排除标准：其他肿瘤病史;接受放射疗法、化学疗法;腹部外科手术史;妊娠期、哺乳期等。根据病情程度分为早中期结直肠癌组(n=20)、晚期结直肠癌组(n=20)，早中期结直肠癌组中男11例，女9例；年龄37～66岁，平均年龄(52.98±2.58)岁；晚期结直肠癌组中男11例，女9例；年龄37～66岁，平均年龄(52.98±2.58)岁。四组一般资料比较，无统计学差异(P>0.05)。

1.2 方法 外周血检测：抽取10ml外周静脉血，放置到EDTA抗凝真空采血管内,经离心处理12min后，分离血浆3.5ml,放置到-20℃环境下。采用PCR荧光探针法试剂盒，按照要求操作，对DNA进行提取，实施亚硫酸盐转化，予以Bis-DNA结合，再予以洗脱，通过PCR反应，判定SEPT9、SFRP2阳性情况。粪便样本检测：在清晨新鲜粪便样本中提取DNA，取200mg粪便标本，根据粪便基因组DNA提取试剂盒进行操作，然后按照DNA清洁试剂盒步骤完成剂盒操作提取，通过分光光度计实施DNA纯度检测，通过电泳、凝胶成像系统确定DNA是否完整，若不完整需再次提取。若DNA完整，可实施重亚硫酸氢盐处理，采用PCR扩增，予以琼脂糖凝胶电泳分析，使之保持甲基化状态，对SEPT9、SFRP2阳性进行判断。

1.3 观察指标 比较四组单独外周血、粪便样本SEPT9、SFRP2检出率，且比较四组外周血联合粪便样本SEPT9、SFRP2检出率。

2 结果

2.1 四组外周血SEPT9、SFRP2检出率比较 早中期结直肠癌组、晚期结直肠癌组外周血SEPT9、SFRP2检出率均明显高于健康组、腺瘤组，且晚期结直肠癌组外周血SEPT9、SFRP2检出率高于早中期结直肠癌组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 四组外周血SEPT9、SFRP2检出率比较[n(%)]

2.2 四组粪便样本中SEPT9、SFRP2检出率比较 早中期结直肠癌组、晚期结直肠癌组粪便样本中SEPT9、SFRP2检出率均明显高于健康组、腺瘤组，且晚期结直肠癌组粪便样本中SEPT9、SFRP2检出率高于早中期结直肠癌组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 四组粪便样本中SEPT9、SFRP2检出率比较[n(%)]

2.3 四组外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率比较 早中期结直肠癌组、晚期结直肠癌组外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率均明显高于健康组、腺瘤组，且晚期结直肠癌组外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率高于早中期结直肠癌组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。且与表1、表2相比较，外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率高于单独使用外周血、粪便检测结果，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 四组外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率比较[n(%)]

3 讨论

表观遗传学在广义上指基因DNA序列虽未出现变化，但表达出现可遗传改善，由RNA、DNA、蛋白质等对基因表达进行调控，由此使基因表型出现变化[4]。因此，对癌症相关基因表达进行调控可对癌症进行合理控制[5]。DNA甲基化指通过DNA甲基转移酶作用,胞嘧啶第5位碳原子加一个甲基基团,可使染色质空间构象发生变化,对DNA转录、表达具有明显抑制作用,利于其长时间保持静默。当抑癌基因出现异常甲基化,正常转录、翻译受明显抑制,无法形成抑癌蛋白,极易引发肿瘤疾病[6]。因此采用DNA甲基化对癌症进行早筛具有重要意义。

经研究可知，早中期结直肠癌组、晚期结直肠癌组外周血SEPT9、SFRP2检出率均明显高于健康组、腺瘤组，且晚期结直肠癌组外周血SEPT9、SFRP2检出率高于早中期结直肠癌组；早中期结直肠癌组、晚期结直肠癌组粪便样本中SEPT9、SFRP2检出率均明显高于健康组、腺瘤组，且晚期结直肠癌组粪便样本中SEPT9、SFRP2检出率高于早中期结直肠癌组；早中期结直肠癌组、晚期结直肠癌组外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率均明显高于健康组、腺瘤组，且晚期结直肠癌组外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率高于早中期结直肠癌组；外周血联合粪便SEPT9、SFRP2检出率高于单独使用外周血、粪便检测结果(P<0.05)。因此可知，采用外周血循环和粪便样本实施DNA甲基化技术，对结直肠癌具有较高的筛查价值。机体中肠道保持碱性环境，可使DNA得以保存，并有效提取[7]。若机体出现肿瘤,往往导致粪便内出现肿瘤脱落癌细胞、游离肿瘤DNA。通过对粪便标本应用基因甲基化技术，可使肿瘤得到有效筛查[8]。外周血内含有大量游离肿瘤DNA，通过对其进行DNA甲基化技术检测，可对结直肠癌进行评估。SFRP2是一种Wnt信号通路拮抗物，可与Writ信号蛋白质产生作用，由此使Wnt信号受到明显阻碍，是一种肿瘤抑制基因，可对Wnt信号进行有效调控，对结直肠癌发生发展具有明显参与作用。SEPT9在结直肠癌疾病中往往出现甲基化，是诊断结直肠癌的重要生物标志物[9]。SFRP2、SEPT9在结直肠癌均具有较高检测价值，通过外周血循环和粪便样本的测定，可有效评估癌变情况。

总之，外周血循环和粪便样本实施DNA甲基化技术对结直肠癌早筛具有重要作用，可推广使用。