特异性抗镰刀菌感染鸡卵黄抗体的制备及其抗镰刀菌作用

林静 刘星 彭旭东 李翠 隋建新 赵桂秋

1青岛大学附属医院眼科，青岛 266003；2中国海洋大学食品科学学院，青岛 266003

真菌性角膜炎是一种由致病真菌感染引起的严重致盲眼病。植物性外伤是其主要的发病诱因，因此其在以农业生产为主的发展中国家发病率较高[1-2]。真菌性角膜炎的致病菌属主要包括镰孢菌属、曲霉菌属、念珠菌属和弯孢菌属，以镰刀菌和烟曲霉菌常见[3]。在我国，镰刀菌导致真菌性角膜炎的发病率逐年升高。真菌性角膜炎起病缓慢、病程长，与病毒性或细菌性角膜溃疡相比，真菌性角膜溃疡预后更差。目前在临床中常用的抗真菌药物主要有多烯类(两性霉素B)、唑类(伏立康唑、氟康唑)、棘白菌素类(卡泊芬净、米卡芬净)和环孢素类等[4]。由于抗真菌药物的毒性和不良反应较大，局部渗透性差且刺激性强，限制了其在真菌性角膜炎中的应用[5]，因此亟需寻找毒性低、抗真菌效果好、渗透性强的药物来增加局部作用效果并减轻全身毒性作用。鸡卵黄抗体(yolk immunoglobulin，IgY)是将抗原通过注射的方式免疫禽类后，通过其免疫系统产生并蓄积在卵细胞中的特异性抗体。母鸡产生IgY是为了给后代提供对常见禽病原体有效的体液免疫，直至后代自身免疫系统完全成熟。IgY具有产量高、易获得、价格低廉、毒性低、对温度和pH具有良好的耐受性等特点，已经在疾病诊断和治疗等方面有广泛的研究和应用[6-8]。研究表明，用细菌、真菌、病毒等病原体作为抗原免疫蛋鸡后，均能使蛋鸡产生针对特定抗原的IgY[9]，产生的特异性IgY能够有效抑制痢疾志贺菌、轮状病毒、白念珠菌、毛癣霉菌等的生长，并在口腔念珠菌感染、皮肤毛癣霉病等多种疾病中具有较好的治疗效果[10-13]。但是到目前为止，特异性IgY在真菌性角膜炎中的作用尚不清楚。本实验拟制备特异性抗镰刀菌的IgY，并检测其抗真菌作用及对温度和pH的耐受性，以期为真菌性角膜炎的药物治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验对象及来源 标准镰刀菌菌株(NO.3.01829)(中国普通微生物保藏中心提供)。22周龄莱杭母鸡18只，体质量约1 kg(青岛森淼公司提供)。健康8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠12只(济南朋悦公司)，均经过检验及检疫，眼前节无明显异常。小鼠饲养环境温度控制在18～22 ℃，湿度为50%～60%，室内明暗循环各12 h。实验动物的使用遵循美国眼科和视觉研究协会关于实验动物使用的原则和标准，本研究方案经青岛大学附属医院实验动物伦理委员会审核批准(批文号：QYFYWZLL26168)。

1.1.2主要试剂及仪器 沙氏培养基、沙氏Agar培养基、Bradford法蛋白浓度测定试剂盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(北京索莱宝公司)；DMEM(美国HyClone公司)；弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂、辣根酶标记兔抗鸡IgG(美国Sigma公司)；优级纯硫酸铵(天津科密欧化学试剂开发中心)。透气封口膜(上海富雪生物科技有限公司)；普兰德封口膜(上海生物公司)；角膜板层刀(美国Alcon公司)；5-0带线缝合针(宁波医用缝针公司)；体式显微镜(德国Carl Zeiss公司)；-80 ℃和4 ℃冰箱、超净工作台、冻干机(美国Thermo Scientific公司)；全套移液器、低温高速离心机(5810R)(德国Eppendorf公司)；高压立式蒸汽灭菌器(日本Tomy公司)；酶标仪(美国Thermo Forma公司)；恒温培养箱(上海力康公司)；裂隙灯显微镜(日本拓普康公司)。

1.2 方法

1.2.1特异性IgY的制备 取出冻存的标准镰刀菌菌株于超净工作台中溶解吹打后接种在沙氏Agar培养基，置于28 ℃恒温箱中5～7 d，刮取镰刀菌的孢子及菌丝接种于含沙氏培养基的无菌细胞培养瓶内，透气封口膜封口，在37 ℃摇床培养箱内120 r/min条件下培养约5 d。收集细胞培养瓶内的镰刀菌菌丝于离心管内研磨充分后在离心半径13.5 cm，12 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，弃上清，无菌PBS充分洗涤菌液3遍。加入体积分数75%乙醇充分混匀后于4 ℃冰箱过夜灭活菌丝。次日再次12 000 r/min离心15 min，弃去75%乙醇，用无菌PBS洗涤3遍，加入DMEM培养液混匀，配制成终浓度为2×107菌落形成单位(colony forming units，CFU)/ml的菌丝刺激液。采用随机数表法将18只莱杭母鸡随机分为阴性对照组和实验组，每组9只。取菌悬液与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，取1 ml混合液于实验组鸡的颈部、双翅及胸肌处皮下散点注射，2周后换为弗氏不完全佐剂加强免疫1次。收集免疫后的鸡蛋，4 ℃储存备用。同时以氯化钠溶液代替菌悬液按照同样方式对阴性对照组莱杭母鸡进行注射，以制备非特异性抗体作为实验中的阴性对照。取免疫后蛋黄20 g，用灭菌双蒸水稀释至质量浓度为90 mg/ml，混匀后调节pH至5.0，4 ℃静置过夜。4 ℃条件下10 000 r/min离心30 min，取上清液过滤，收集滤液。向滤液中加入50%饱和度的优级纯硫酸铵，4 ℃条件下搅拌30 min并静置2 h以使蛋白沉淀。4 ℃条件下10 000 r/min离心15 min，弃上清。将离心所得沉淀溶解于适量的PBS中，再加入33%饱和度的优级纯硫酸铵进行二次盐析，4 ℃条件下搅拌20 min后静置40 min以使蛋白沉淀。4 ℃条件下10 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀溶解于适量的PBS中，充分透析后获得IgY溶液。将得到的IgY蛋白液体放入冻干机中制作成冻干粉，4 ℃保存。

1.2.2考马斯亮蓝法测定特异性IgY蛋白浓度 将考马斯亮蓝工作液分别加到一系列不同浓度标准蛋白质BSA溶液中，振荡摇匀，15 min后，测定波长595 nm处吸光度(absorbance,A)值，以蛋白质浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘成标准曲线。取第5～16周适宜体积待测样品，使其测定值在标准曲线的线性范围内，根据所测定的A595值，计算出待测样品的蛋白质浓度。

1.2.3间接酶联免疫吸附法测定特异性IgY效价 取第5～16周IgY，将质量浓度调整至100 mg/ml，用2×107CFU/ml镰刀菌丝包被96孔免疫板。分别以PBS和阴性IgY提取液作为空白对照和阴性对照，浓度与特异性抗镰刀菌IgY的稀释梯度一致。辣根酶标记兔抗鸡IgG按1∶ 2 500稀释，每孔100 μl，TMB显色剂显色后，1 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定A450值。抗体的效价定义为样品A450与阴性对照A450的比值≥2.1时所需要的样品最大稀释倍数。

1.2.4特异性IgY体外抑菌活性的测定 将1×105CFU/ml和1×103CFU/ml镰刀菌悬液与效价为1∶ 10 000的不同浓度特异性IgY混合培养4 d后用酶标仪测定A600值。用PBS及阴性卵黄抗体与镰刀菌液共孵育分别作为空白对照组和阴性IgY组，绘制抑菌曲线。

1.2.5特异性IgY热稳定性的测定 将特异性IgY用pH 7.4的PBS稀释至0.02 mg/ml，分别在30、40、50、60、70、80和90 ℃水浴中孵育30 min，室温冷却后，以2×107CFU/ml镰刀菌丝包被96孔板，以间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法测定不同温度处理后IgY的活性。

1.2.6特异性IgY酸碱稳定性的测定 将特异性IgY分别用pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的PBS稀释至0.02 mg/ml，并在4 ℃条件下放置l h，以2×107CFU/ml的镰刀菌丝包被96孔板，以间接ELISA法测定不同pH条件处理后IgY的活性。

1.2.7小鼠镰刀菌性角膜炎模型的建立及处理 采用随机数表法将12只小鼠随机分为PBS对照组和特异性IgY治疗组，每组6只。腹腔内注射质量分数8%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉C57BL/6小鼠，在体式显微镜下，用板层刀刮除约2 mm直径范围的右眼中央角膜上皮组织以形成角膜缺损，将10 μl镰刀菌菌悬液点于角膜上并用封口膜自制的软性角膜接触镜覆盖，用5-0带线缝合针缝合上下眼睑。建模后1 d，特异性IgY治疗组用200 mg/ml特异性抗镰刀菌IgY点眼，PBS对照组用PBS点眼，每2 h点1次。于镰刀菌感染后1、3和5 d在裂隙灯显微镜下观察并拍照，参照文献[14]的标准对小鼠镰刀菌性角膜炎的严重程度进行分级(表1)。

表1 小鼠真菌性角膜炎模型炎症分级[14]Table 1 Inflammation grading in mouse model of fungal keratitis[14]项目Ⅰ级(1分)Ⅱ级(2分)Ⅲ级(3分)Ⅳ级(4分)溃疡面积(%)1-2526-5051-7576-100混浊程度 虹膜纹理尚清,瞳孔可见,角膜轻度混浊虹膜可见,角膜较混浊虹膜不可见,角膜不均匀混浊角膜均匀,重度混浊溃疡形态 轻度不规则 轻度水肿、不规则 重度水肿,龛样溃疡,或后弹力层膨出穿孔或后弹力层膨出 注:3项分数相加为最终炎症得分 Note:The final inflammation score was the sum of the three items

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 特异性抗镰刀菌IgY的浓度及效价测定

考马斯亮蓝法测定IgY浓度标准曲线见图1，根据标准曲线测得第5～16周的特异性IgY的蛋白质量浓度分别为1.57、2.89、24.98、25.09、23.89、25.78、21.57、21.37、18.98、15.78、14.67和12.67 mg/ml。特异性抗镰刀菌IgY的效价从第5周开始升高，第7周时达到最高效价，为1∶ 10 000，可维持至免疫后第12周，从第12周开始效价缓慢下降(图2)。

图1 考马斯亮蓝法测定IgY浓度标准曲线 根据标准曲线公式Y=0.507X+0.557(R2=0.990)测得蛋白质量浓度 A:吸光度Figure 1 Bradford assay standard curve of IgY concentration versus absorbance The IgY concentration was calculated according to the equation Y=0.507X+0.557 (R2=0.990) A:absorbance

图2 间接ELISA法测定第5～16周IgY效价 特异性抗镰刀菌IgY的效价从第5周开始升高，第7周时达到最高效价，为1∶ 10 000，可维持至免疫后第12周，从第12周开始效价开始缓慢下降 IgY:鸡卵黄抗体Figure 2 Indirect ELISA method to determine the titer of IgY in 5-16 weeks following immunization The titer of IgY was increased from the 5th week and reached the highest titer 1∶ 10 000 at the 7th week,which could be maintained until the 12th week after immunization.The titer began to decline slowly from the 12th week IgY:yolk immunoglobulin

2.2 特异性抗镰刀菌IgY抑制镰刀菌生长的抑菌曲线

抑菌曲线显示，特异性IgY治疗组的抑菌效果明显好于空白对照组及阴性IgY组，250 mg/ml的特异性IgY可完全抑制1×105CFU/ml的镰刀菌生长(图3)，100 mg/ml的特异性IgY可完全抑制1×103CFU/ml镰刀菌的生长(图4)。

图3 各组对1×105 CFU/ml镰刀菌悬液的抑菌曲线 特异性IgY治疗组的抑菌效果明显好于空白对照组及阴性IgY组，250 mg/ml的特异性IgY可完全抑制1×105 CFU/ml的镰刀菌生长 CFU：菌落形成单位;IgY:鸡卵黄抗体Figure 3 Concentration-bactericidal curve of different groups against 1×105 CFU/ml Fusarium suspension The antifungal effect of the specific IgY group against Fusarium was significantly better than the blank group and the negative IgY group.The specific IgY with a concentration of 250 mg/ml could completely inhibit the growth of Fusarium of 1×105 CFU/ml CFU：colony forming units;IgY:yolk immunoglobulin

图4 各组对1×103 CFU/ml镰刀菌悬液的抑菌曲线 特异性IgY治疗组的抑菌效果明显好于空白对照组及阴性IgY组，质量浓度为100 mg/ml的特异性IgY可完全抑制1×103 CFU/ml镰刀菌的生长 CFU：菌落形成单位;IgY:鸡卵黄抗体Figure 4 Concentration-bactericidal curve of different groups against 1×103 CFU/ml Fusarium suspension The antifungal effect of the specific IgY group against Fusarium was significantly better than the blank group and the negative IgY group.The specific IgY with a concentration of 100 mg/ml could completely inhibit the growth of Fusarium of 1×103 CFU/ml CFU：colony forming units;IgY:yolk immunoglobulin

2.3 特异性IgY对不同温度和pH的耐受性

效价高于1∶ 10 000的特异性IgY在60 ℃以下具有较好的热稳定性，效价无明显变化，60 ℃以上抗体效价明显下降(图5)；特异性IgY在pH 4～6具有最高的活性，在pH 3～9的条件下能够维持活性；随着pH值的进一步降低或者升高，其活性迅速降低(图6)。

图5 不同温度对特异性IgY效价的影响 效价高于1∶ 10 000的特异性IgY在30～60 ℃间效价无明显变化，60 ℃以上抗体效价明显下降 IgY:鸡卵黄抗体Figure 5 Effect of temperature on the titer of specific IgY There was no significant change in the titer of the specific IgY with a titer higher than 1∶ 10 000 in the range of 30-60 °C,and the titer was decreased significantly when the temperature reached above 60 ℃ IgY:yolk immunoglobulin

图6 不同pH对特异性IgY效价的影响 效价高于1∶ 10 000的特异性IgY在pH 4～6具有最高的活性，在pH 3～9的条件下能够维持活性；随着pH值的进一步降低或者升高，其活性迅速降低 IgY:鸡卵黄抗体Figure 6 Effect of pH on the titer of specific IgY There was the highest activity of the specific IgY with a titer higher than 1∶ 10 000 at pH 4-6,which could be maintained at pH 3-9.With the decrease or increase of pH,the activity was reduced rapidly IgY:yolk immunoglobulin

2.4 特异性IgY治疗组与PBS对照组角膜炎症评分比较

镰刀菌感染后3 d和5 d，与PBS对照组相比，特异性IgY治疗组小鼠角膜混浊面积减小、溃疡程度减轻(图7)。镰刀菌感染后1、3和5 d，PBS对照组和特异性IgY治疗组不同时间点炎症评分总体比较，差异均有统计学意义(F分组=247.35，P<0.05；F时间=23.19，P<0.05；F交互作用=32.10，P<0.05)。镰刀菌感染后1 d，2个组炎症评分比较差异无统计学意义(P=0.610)；镰刀菌感染后3 d和5 d，与PBS对照组相比，特异性IgY治疗组炎症评分降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表2)。

图7 特异性IgY治疗组与PBS对照组小鼠角膜形态及炎症程度比较 裂隙灯显微镜下观察可见，感染后3 d和5 d，与PBS对照组相比，特异性IgY治疗组小鼠角膜混浊面积缩小，溃疡程度和炎症程度均明显减轻 PBS：磷酸盐缓冲液;IgY:鸡卵黄抗体Figure 7 Comparison of morphology of mice cornea and degree of inflammation between the two groups At 3 and 5 days after infection,there was a smaller area of corneal opacity,relieved ulceration and inflammation in the specific IgY treatment group compared with the PBS group PBS：phosphate buffered saline;IgY:yolk immunoglobulin

表2 2个组镰刀菌感染后不同时间点小鼠角膜炎症评分比较(x±s)Table 2 Comparison of corneal inflammation scores of mice at various time points after Fusarium infection between the two groups (x±s)组别样本量感染后不同时间点小鼠角膜炎症评分1 d3 d5 dPBS对照组63.50±0.557.33±0.824.00±0.63特异性IgY治疗组63.33±0.824.17±0.75a2.50±0.55 a 注:F分组=247.35,P<0.05;F时间=23.19,P<0.05;F交互作用=32.10,P<0.05.与PBS对照组比较,aP<0.05(重复测量两因素方差分析,LSD-t检验) PBS:磷酸盐缓冲液;IgY:鸡卵黄抗体 Note:Fgroup=247.35,P<0.05;Ftime=23.19,P<0.05;Finteraction=32.10,P<0.05.Compared with the PBS control group,aP<0.05 (Two-way repeated measures ANOVA,LSD-t test) PBS:phosphate buffered saline;IgY:yolk immunoglobulin

3 讨论

IgY来自于被抗原免疫后的蛋鸡卵黄。国内外大量研究发现，特异性针对病原体的IgY可被应用于病原体感染性疾病的诊断及治疗[15]。IgY不仅具有抗原结合力，而且对其抗原菌的生长具有明显抑制作用。尽管其作用机制尚不明确，IgY应用于动物病原菌的被动免疫在病原体相关疾病的预防和治疗中有重要作用[16-18]。特异性IgY能够有效抑制鲍曼不动杆菌、轮状病毒、白念珠菌、毛癣霉菌等的生长。在小鼠模型中应用特异性IgY能够减轻口腔念珠菌感染、皮肤毛癣霉病等多种疾病的严重程度[8,10]。但特异性针对镰刀菌的IgY未见相关报道。

本研究制备了特异性针对镰刀菌的IgY，并验证了其抗真菌作用。我们用镰刀菌菌丝作为抗原，与弗氏佐剂混合，采用颈部、双翅及胸肌等多处皮下散点注射的方式免疫莱杭母鸡，2周后更换为弗氏不完全佐剂加强免疫1次。用硫酸铵盐析法从免疫后的莱杭母鸡卵黄中提取出特异性IgY，并检测了效价。结果显示，特异性IgY的最高效价可达到1∶ 10 000，在免疫后5周效价开始升高，7～12周时效价最高，12周后效价开始下降。研究显示，鸡卵黄抗体在免疫制备过程中，免疫的途径、注射部位、抗原用量、间隔时间、免疫次数等都是影响免疫效果的因素[19]。本实验结果表明，镰刀菌的菌丝在颈部、双翅及胸肌等多处皮下散点注射的方式能够充分引起蛋鸡的免疫，而且硫酸铵盐析法可高效提取IgY，与文献[20]研究结果一致。既往实验中，提取IgY的方法可分为4种，即硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法、冰乙醇法和聚乙二醇沉淀法[21]。硫酸铵盐析法提取产物的抗体效价最高，且产量大，是较为理想的提取纯化方法。另外有研究表明，针对白念珠菌的IgY可以封闭白念珠菌的表面抗原，防止白念珠菌菌丝体转变，引起凝集，从而抑制白念珠菌的生长[18]。本研究发现，与空白对照组及阴性IgY组相比，特异性IgY可显著抑制镰刀菌生长，这为特异性IgY成为新型抗真菌药提供了研究基础。另外，在小鼠镰刀菌性角膜炎中，特异性IgY治疗组小鼠角膜混浊面积、溃疡程度、炎症程度均明显减轻，炎症评分显著降低，这表明特异性IgY对小鼠的镰刀菌性角膜炎具有治疗作用，有望作为天然生物抑菌剂应用于镰刀菌性角膜炎的治疗中。IgY作为一种蛋白类物质，在应用中对温度及酸碱度的耐受性非常重要。本实验测定了特异性IgY对酸碱度和温度的耐受力，结果显示抗体效价高于1∶ 10 000的特异性IgY在60 ℃以下具有较好的热稳定性；抗体在pH 4～6具有最高的活性，在pH 3～9的条件下能够维持活性，随着pH值的进一步降低或者升高，其活性迅速降低，与既往研究结果一致[21-23]。IgY良好的温度及酸碱耐受性为其大量制备和广泛应用提供了基础。

综上所述，本研究结果显示采用硫酸铵盐析法可成功制备高产量、高效价的特异性IgY，该抗体可显著抑制镰刀菌生长，在小鼠镰刀菌性角膜炎模型中降低角膜炎症评分，减轻角膜溃疡的严重程度，并且其稳定性高，对温度和酸碱度均有一定的耐受性。高效价特异性IgY作为一种新的天然抑菌剂，有望应用于真菌性角膜炎的治疗中。

利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明林静：分析/解释数据，酝酿和设计实验，对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费；刘星：实施研究，分析/解释数据，起草文章；彭旭东：对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析；李翠：分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅；隋建新：对文章的知识性内容作批评性审阅；赵桂秋：对文章的知识性内容作批评性审阅，提供研究经费，行政、技术或材料支持