腐皮镰孢菌对角膜上皮细胞AMPK磷酸化及IL-6表达的影响

魏静静 谢艳亭 岳娟 董军璐 司玮 王春梅 张红敏 王丽娅

郑州大学人民医院 河南省人民医院眼科 河南省立眼科医院 河南省眼科研究所 河南省眼科与视觉科学重点实验室，郑州 450003

腺嘌呤核糖核苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是一种由α、β和γ亚基组成的异源三聚体蛋白激酶，参与调节葡萄糖、脂质以及蛋白质的代谢和维持能量稳态，被称为细胞能量调节器[1-2]。近年来研究发现，AMPK信号通路除在能量代谢调节方面起关键作用外，在感染和宿主防御方面也起到重要作用[3-4]。真菌性角膜炎是由致病真菌引起的严重感染性、致盲眼病，临床抗真菌类滴眼制剂种类有限，治疗棘手[5-6]。位于角膜组织最外层的上皮细胞是角膜防御致病微生物侵袭的第一道屏障，是防御真菌感染的关键，目前角膜上皮细胞是否存在AMPK磷酸化尚不清楚。在真菌性角膜炎炎症初期及进展期，大量多形核中性粒细胞浸润[7]，白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)是一种由184个氨基酸组成的单链糖蛋白[8]，其能促进多形核中性粒细胞的激活[9]。IL-6以自分泌-旁分泌的方式起作用，诱导驻留的角膜细胞产生巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-2和MIP-1α[10]，MIP能促进角膜局部炎症免疫细胞聚集，从而发挥杀菌作用。本实验拟研究角膜上皮细胞是否存在AMPK磷酸化以及真菌对角膜上皮细胞AMPK磷酸化及IL-6表达的影响，探讨AMPK磷酸化和IL-6在真菌性角膜炎中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞和菌株来源 人永生化角膜上皮细胞系CRL-11135 HCE-2(50.B1)(美国ATCC公司)。腐皮镰孢菌(编号：3.5840)(中国科学院微生物研究所)。

1.1.2主要试剂及仪器 上样缓冲液SDS-PAGE(CW0028A，北京康为世纪生物科技有限公司)；PAGE凝胶快速制备试剂盒(PG113，上海雅酶生物医药科技有限公司)；预染蛋白marker(#26616，美国Thermo公司)；发光底物HRP(ECL发光液)(WBKLS0100)、PVDF膜(IPVH00010)(美国Millipore公司)；磷酸酶抑制剂Cocktail Ⅱ(HY-K0022)、蛋白酶抑制剂(HY-K0011)、AMPK磷酸化激动剂5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside，AICAR)(HY13417)、AMPK磷酸化抑制剂化合物C(HY-13418)(美国MCE公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)、RIPA裂解液(#R0010)(北京索莱宝科技有限公司)；IL-6酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂(E-EL-H0102c)、β-actin(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；磷酸化AMPK(p-AMPK)α1(Thr172)(40H9)兔单克隆抗体(#2535S)、AMPKα(D5A2)兔单克隆抗体(#5831S)(美国CST公司)；HRP标记山羊抗兔(111-035-003，美国Jackson公司)。实时无标记细胞多功能分析仪(xCELLigence RTCA S16，杭州艾森生物有限公司)；多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司)；蛋白电泳仪、化学发光仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1实时无标记细胞多功能分析仪筛选AICAR和化合物C安全浓度 复苏人永生化角膜上皮细胞，待生长状态良好后给予传代，在E-Plate 16孔板中加入50 μl培养基，置于RTCA Station完成基线测定，并确定所选择的孔接触正常，向每孔加入含2.0×104个细胞的细胞悬液，每个浓度设置3个复孔，培养12 h，使细胞充分贴壁，待培养至对数生长期时，向每孔中分别加入浓度梯度为100、300、500和1 000 μmol/L的AICAR以及浓度梯度为10.0、12.5、15.0、17.5和20.0 μmol/L的化合物C，以未处理细胞作为对照，加药结束后设置对应孔的药物名称和药物浓度及相关参数，将实时无标记细胞多功能分析仪放入37 ℃、体积分数5% CO2、95%湿度的细胞培养箱中，培养至平台期，观察角膜上皮细胞生长指数，确定药物对角膜上皮细胞作用的安全浓度范围。实验重复4次，取平均值。

1.2.2细胞分组及处理 将角膜上皮细胞分为正常对照组、孢子对照组、AICAR组和化合物C组，以单纯角膜上皮细胞作为正常对照组，角膜上皮细胞与孢子共培养作为孢子对照组，在孢子对照组基础上分别加入AICAR和化合物C作为AICAR组和化合物C组。以每孔5.0×106个细胞铺板，按孢子与角膜上皮细胞数量比为1∶ 1的比例，将孢子加入到含细胞的孔板中混匀，每组均设3个复孔，按照对应的分组加入AICAR和化合物C，根据AICAR、化合物C对角膜上皮细胞作用的安全浓度范围，选取AICAR和化合物C的终浓度分别为1 000 μmol/L和10.0 μmol/L，放入细胞培养箱中培养4 h，备用。本课题组前期预实验结果显示，角膜上皮细胞与孢子共培养4 h时角膜上皮细胞AMPK磷酸化的刺激作用最强，故本实验中选择4 h为培养时间。

1.2.3Western blot法检测p-AMPK和AMPK蛋白在角膜上皮细胞中的表达 培养结束后收集细胞，用RIPA裂解液(预先加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)冰上裂解细胞提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按照说明配制质量分数12.5% SDS-PADG凝胶，110 V恒压电泳1 h，湿转法120 V恒压转膜1 h至PVDF膜。采用质量分数5%牛血清白蛋白溶液室温封闭1 h，去除封闭液，分别浸入p-AMPKα1(Thr172)兔单克隆抗体(1∶ 200)和AMPKα兔单克隆抗体(1∶ 1 000)中，4 ℃孵育过夜，复温后用含Tween 20的磷酸盐缓冲液洗膜3次；浸入HRP标记山羊抗兔IgG(1∶ 1 000)室温孵育1 h，洗膜后加入ECL液用化学发光仪进行显影，以β-actin为内参。采用ImageJ分析软件测定条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。实验重复4次，取平均值。

1.2.4ELISA法测定角膜上皮细胞上清液中IL-6质量浓度 各组培养4 h后收集细胞培养上清液，按照试剂盒说明书进行如下操作：将标准品倍比稀释后依次加入到酶标板孔内，每孔100 μl，均设3个复孔；于其他孔中加入100 μl待测样品细胞上清原液，给予酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min。倒去孔内液体，加入100 μl生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min。向每孔加入350 μl洗涤液，洗涤3次。加入100 μl酶结合物工作液，37 ℃孵育30 min。进行5次洗涤，加入90 μl底物溶液，37 ℃孵育15 min，加入50 μl终止液，立即用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度(A)值，用A540值进行校正，绘制标准曲线，得到公式后代入数据计算IL-6的质量浓度。实验重复4次，取平均值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 AMPK激动剂AICAR对角膜上皮细胞作用的安全浓度范围

不同浓度AICAR作用于角膜上皮细胞不同时间后，细胞指数总体比较差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)，表明AICAR安全范围较广，在100～1 000 μmol/L均无角膜上皮细胞毒性作用。前期预实验结果显示，1 000 μmol/L的AICAR对角膜上皮细胞AMPK磷酸化的刺激作用最强，因此，选择1 000 μmol/L作为AICAR后续实验的终浓度。

表1 不同浓度AICAR作用于角膜上皮细胞不同时间后细胞指数比较(x±s)Table 1 Comparison of cell index of AICAR-treated corneal epithelial cells at various time points among different concentrations of AICAR (x±s)AICAR浓度(μmol/L)样本量细胞指数12 h24 h36 h48 h60 h72 h041.02±0.142.67±0.053.95±0.174.84±0.024.76±0.224.90±0.1610040.99±0.132.51±0.163.70±0.174.37±0.264.47±0.434.58±0.5030041.05±0.112.51±0.183.66±0.634.34±0.624.42±0.794.55±0.6250040.96±0.142.58±0.034.02±0.464.79±0.344.83±0.664.89±0.641 00040.96±0.192.44±0.153.92±0.254.85±0.314.89±0.454.98±0.55F值0.2031.2830.5311.4960.4720.438P值0.9310.3400.7160.2750.7560.779 注:(单因素方差分析) AICAR:5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸 Note:(One-way ANOVA) AICAR:5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside

2.2 AMPK抑制剂化合物C对角膜上皮细胞作用的安全浓度范围

不同浓度化合物C作用于角膜上皮细胞后24、36、48、60和72 h，细胞指数总体比较差异均有统计学意义(F=24.106、61.937、125.858、378.399、229.704，均P<0.001)，其中17.5 μmol/L和20.0 μmol/L化合物C作用后24 h细胞指数均低于对照组，15.0、17.5和20.0 μmol/L化合物C作用后36、48、60和72 h细胞指数均低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)(表2)，表明10.0～12.5 μmol/L化合物C对角膜上皮细胞无毒性作用。前期预实验结果显示，10.0 μmol/L化合物C对角膜上皮细胞AMPK磷酸化表达即有较好的抑制作用，因此，选择10.0 μmol/L作为化合物C后续实验的终浓度。

表2 不同浓度化合物C作用于角膜上皮细胞不同时间后细胞指数比较(x±s)Table 2 Comparison of cell index of Compound C-treated corneal epithelial cells at various time points among different concentrations of Compound C (x±s)化合物C浓度(μmol/L)样本量细胞指数12 h24 h#36 h*48 h*60 h#72 h*041.00±0.122.66±0.053.69±0.554.88±0.074.83±0.174.92±0.1510.041.21±0.462.71±0.194.08±0.344.81±0.224.94±0.395.02±0.2912.541.19±0.302.39±0.363.88±0.464.77±0.275.40±0.055.46±0.0415.041.41±1.031.77±0.861.76±0.55a1.77±0.58a1.29±0.34a1.04±0.43a17.540.48±0.110.42±0.12a0.18±0.11a0.29±0.28a0.10±0.01a0.07±0.00a20.040.39±0.230.22±0.13a0.25±0.14a0.38±0.44a0.12±0.08a0.37±0.47aF值2.17824.10661.937125.858378.399229.704P值0.125<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:与各自对照组(0 μmol/L)比较,aP<0.01(单因素方差分析,#:Tamhane T2检验;*:LSD-t检验) Note:Compared with the respective control group (0 μmol/L),aP<0.01 (One-way ANOVA,#:Tamhane T2 test;*:LSD-t test)

2.3 真菌孢子对角膜上皮细胞AMPK磷酸化的影响

Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，孢子对照组和AICAR组p-AMPK蛋白表达条带增强，化合物C组p-AMPK蛋白表达条带减弱；各组AMPK蛋白表达条带无明显变化(图1A)。正常对照组、孢子对照组、AICAR组和化合物C组p-AMPK相对表达量分别为0.67±0.15、2.57±0.12、3.67±0.58和1.50±0.50，各组间总体比较差异有统计学意义(F=32.820，P<0.001)，其中孢子对照组p-AMPK相对表达量较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)；AICAR组较孢子对照组p-AMPK相对表达量明显升高，化合物C组较孢子对照组p-AMPK相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(均P=0.010)(图1B)。正常对照组、孢子对照组、AICAR组和化合物C组AMPK相对表达量分别为1.09±0.74、1.47±0.78、1.45±0.96和1.29±1.04，各组总体比较差异无统计学意义(F=0.120，P=0.950)(图1C)。

图1 真菌孢子诱导的角膜上皮细胞p-AMPK和AMPK蛋白表达 A：Western blot法检测电泳图 B：各组角膜上皮细胞中p-AMPK蛋白定量结果比较 F=32.820，P<0.001.与正常对照组比较，aP<0.01；与孢子对照组比较，bP<0.05(单因素方差分析，LSD-t检验，n=4) C：各组角膜上皮细胞中AMPK蛋白定量结果比较 F=0.120，P=0.950(单因素方差分析，n=4) 1：正常对照组；2：孢子对照组；3：AICAR组；4：化合物C组 p-AMPK：磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶；AMPK：腺嘌呤核糖核苷酸活化的蛋白激酶；β-actin：β-肌动蛋白 图2 各组角膜上皮细胞培养上清液中IL-6质量浓度比较 F=15.210，P<0.001.与正常对照组比较，aP<0.01；与孢子对照组比较，bP<0.05(单因素方差分析，LSD-t检验，n=4) 1：正常对照组；2：孢子对照组；3：AICAR组；4：化合物C组 IL：白细胞介素Figure 1 Expression of p-AMPK and AMPK proteins in corneal epithelial cells induced by fungal spores A：Electrophoretogram of p-AMPK and AMPK proteins by Western blot B：Comparison of quantitative results of p-AMPK protein in corneal epithelial cells among different groups F=32.820,P<0.001 Compared with the normal control group,aP<0.01;compared with the spore control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=4) C：Comparison of quantitative results of AMPK protein in corneal epithelial cells among different groups F=0.120,P=0.950 (One-way ANOVA,n=4) 1：Normal control group;2：Spore control group;3：AICAR group;4：Compound C group p-AMPK：phosphorylated adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase;AMPK：adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase Figure 2 Comparison of IL-6 concentration in culture supernatant among different groups F=15.210,P<0.001 Compared with the normal control group,aP<0.01;compared with the spore control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=4) 1：Normal control group;2：Spore control group;3：AICAR group;4：Compound C group IL：interleukin

2.4 真菌孢子对角膜上皮细胞培养上清液中IL-6表达的影响

ELISA法测定结果显示，正常对照组、孢子对照组、AICAR组和化合物C组IL-6质量浓度分别为(107.81±17.15)、(156.32±9.94)、(167.96±14.16)和(127.42±19.75)pg/ml，各组间总体比较差异有统计学意义(F=15.210，P<0.001)，其中孢子对照组IL-6质量浓度较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)；AICAR组IL-6质量浓度较孢子对照组略升高，差异无统计学意义(P=0.260)，化合物C组IL-6质量浓度较孢子对照组明显降低，差异有统计学意义(P=0.010)(图2)。

3 讨论

角膜上皮细胞是上皮类细胞的一种，AMPK磷酸化在上皮类细胞中广泛表达，如肺泡上皮A549细胞、视网膜色素上皮细胞和唾液腺上皮细胞等[11-13]。本研究结果显示，角膜上皮细胞中存在AMPK磷酸化，在真菌诱导的角膜上皮细胞中AMPK磷酸化水平升高，且AICAR可以增强这一效应，化合物C则抑制这一效应。宿主对隐球菌(一种致命的真菌病原体)感染的反应进行全面的磷酸化蛋白质组学分析结果显示，真菌被巨噬细胞摄取后，大量不同的宿主蛋白被差异磷酸化，包括AMPKα[14]，与本研究结果相似，提示AMPK磷酸化参与真菌性角膜炎的致病过程。不仅如此，AMPK磷酸化在细菌、病毒和寄生虫等感染性疾病中亦有重要意义[15-17]。目前，关于AMPK磷酸化在真菌诱导感染性疾病中的研究仍较少，未来可深入研究AMPK磷酸化在真菌感染中的作用机制，寻找致病靶点，为开发更多的抗真菌药物提供基础。

本研究发现真菌诱导的角膜上皮细胞培养上清液中IL-6的质量浓度升高，与既往研究结果相似。灭活的茄病镰刀菌孢子在体外能上调人角膜上皮细胞中核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2 mRNA及蛋白的表达，并促进下游炎性因子IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α蛋白的表达[18]；巴西假单胞菌以蛋白激酶C依赖性方式促进人肺上皮A549细胞分泌IL-6和IL-8[19]；该结果在体内实验中亦得到证实。IL-6在烟曲霉菌性角膜炎大鼠角膜中早期大量表达，中晚期达高峰[20]，黑曲霉刺激增加慢性鼻-鼻窦炎鼻息肉组织中促炎细胞因子IL-6的表达[21]。真菌性角膜炎的免疫反应过程中，病变早期主要是中性粒细胞发挥关键作用[22]，IL-6则能促进小鼠角膜上皮损伤的快速修复，同时伴有角膜中的中性粒细胞和巨噬细胞表达增多[23]。因此，IL-6表达的增加在真菌性角膜感染中是一种保护因素。

本研究发现，真菌刺激角膜上皮细胞后，p-AMPK表达水平和分泌的IL-6质量浓度均升高；在孢子刺激的基础上加入AICAR，p-AMPK表达水平和IL-6质量浓度也升高，但与孢子对照组比较差异无统计学意义，猜测可能是孢子刺激引起角膜上皮细胞培养上清液中的IL-6质量浓度已达到高峰，接近饱和状态，故加入AICAR后IL-6的质量浓度升高幅度不明显；在孢子刺激的基础上加入化合物C作用后，p-AMPK表达水平降低，IL-6的表达亦减少，证明角膜上皮细胞AMPK磷酸化与IL-6的分泌有关。

大量研究显示，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是炎症产生的关键因子，IL-6是激活NF-κB信号传导的刺激因子和激活产物[24-25]。本研究推测，角膜上皮细胞在真菌刺激下激活AMPK，通过NF-κB正反馈调节引起炎症级联反应，以募集中性粒细胞到感染部位。本研究仅对角膜上皮细胞在真菌刺激下AMPK的激活以及产生的IL-6进行了体外研究，并未对磷酸化AMPK促进IL-6产生的机制进行探讨，关于真菌刺激角膜上皮细胞激活AMPK-NF-κB-IL-6通路的假说仍有待进一步的实验验证。

综上所述，本研究发现角膜上皮细胞中存在AMPK磷酸化，在真菌孢子诱导下，角膜上皮细胞AMPK磷酸化增强，IL-6分泌增多，从而促进炎症反应，有利于免疫细胞向感染部位募集，对真菌的彻底清除具有一定的意义。

利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明魏静静：设计实验、实验操作、论文撰写、数据整理、统计分析；谢艳亭、岳娟、董军璐、司玮、王春梅：实验操作、数据分析；张红敏：设计实验、研究指导、论文修改、经费支持；王丽娅：论文修改，研究指导