奈达铂联合吉西他滨阻滞非霍奇金淋巴瘤细胞周期促进细胞凋亡的作用研究

李云霞，赵 玲，赵明利，吕东津，郝 舒，吴 娜，周文鼎

（昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院内三科1，微创介入科2，云南 昆明 650118）

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是由肿瘤细胞引起的恶性免疫系统疾病，主要表现为淋巴结病或实体瘤[1，2]。其分类复杂，世界卫生组织（WHO）已列出了50 多种不同的亚型的组织分类[3]。长期以来，非霍奇金淋巴瘤的标准一线化疗方案为CHOP 方案，即环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松龙[4，5]。然而在一线治疗后，有半数以上患者会转化为复发难治性非霍奇金淋巴瘤，预后较差。针对这类患者的化疗方案不统一，尚无标准治疗方案[6，7]。有研究报道[8-10]，铂类化疗药物和吉西他滨可用于非霍奇金淋巴瘤二线及以上的治疗。有研究比较顺铂、吉西他滨和地塞米松联合治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的效果，结果发现患者实现了较好的临床应答并且安全耐受性良好[11]。奈达铂是新一代的铂类抗肿瘤药物，与顺铂相比，具有更强的细胞毒作用，已在部分国家批准用于多种癌症的治疗[12]。因此，奈达铂有望成为非霍奇金淋巴瘤化疗的药物选择之一。本研究拟探索新型铂类化疗药物奈达铂和吉西他滨联用抑制非霍奇金淋巴瘤细胞的作用机制，以期为临床治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤以及改善患者预后提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 MINO 和SU-DHL-4 非霍奇金淋巴瘤细胞株购自中国科学院细胞库，使用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清，100 μ/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素），在含5%CO2的细胞培养箱中37 ℃下培养。PBS 粉末（索莱宝）完全溶解于2000 ml 蒸馏水中，混匀后，调整pH 值在7.2～7.4，备用。细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒购自ThermoFisher。FITC 标记的CDK1 和CDK4 抗体购自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 MTT 细胞活力实验 在96 孔板中分别接种两种NHL 细胞，密度达到5000 细胞每孔，3 个实验组分别加入4、2、1、0.5 和0.25 nM的吉西他滨和奈达铂以及二者的混合物，另外没有药物处理的细胞作为对照组。培养72 h 后，吸去培养液，每孔加入100 μl的0.5 mg/ml的MTT 在培养箱种孵育4 h。然后弃液体并在每孔加入100 μl的DMSO，待结晶全部溶解，用酶标仪在490 nm 处测量吸光度值。每个浓度进行3 次平行重复实验。

1.2.2 流式细胞仪（FCM）检测细胞周期和细胞凋亡两种NHL 细胞株接种在6 孔板中，以20 万细胞/孔的密度接种，3 个实验组的细胞分别用1 nM 吉西他滨、奈达铂和奈达铂+吉西他滨处理72 h，PBS 清洗3 次之后，使用细胞周期试剂盒进行标记，通过表征每个细胞的DNA 含量并用碘化丙啶（PI）染色进行分析。细胞凋亡实验则在含有5 μl 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的膜联蛋白V 和5 μg/ml的PI的100 μl 钙结合缓冲液中对1×105个完整细胞进行双重染色，在黑暗中孵育15 min，然后通过流式细胞术（FACS）进行分析。

1.2.3 免疫荧光检测细胞周期蛋白依赖激酶CDK1和CDK4的表达 两种NHL 细胞株接种在玻璃底培养皿中，以50 万细胞/孔的密度接种。3 个实验组的细胞分别用1 nM 吉西他滨、奈达铂和奈达铂+吉西他滨处理72 h，弃培液，用PBS 清洗3 次，加入4%多聚甲醛溶液室温固定15 min，重复PBS 清洗过程。用0.1%Triton X-100 处理5 min 后再次清洗。使用5%脱脂奶粉的TBST 封闭细胞在培养箱中孵育1 h 后，分别使用FITC 标记的CDK1 和CDK4 抗体进行标记，继续在培养箱中孵育1 h，用TBST 清洗3 次之后在荧光显微镜下进行检测。绿色荧光强度代表CDK1 和CDK4的表达量，比较奈达铂组、吉西他滨组、奈达铂+吉西他滨组和对照组的荧光强度。

1.3 统计学分析 实验数据的分析处理采用Graphpad Prism 7.0 进行，计量资料以（）表示，行非配对Students't检验；计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验；P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 奈达铂组、吉西他滨组和奈达铂+吉西他滨组细胞活力比较 奈达铂组、吉西他滨组和奈达铂+吉西他滨组均抑制两种NHL 细胞株的增殖，其中奈达铂+吉西他滨组抑制效果最显著，且随着药物等比稀释浓度逐渐降低，细胞活力的抑制率也逐渐降低；另外，奈达铂组和吉西他滨组的抑制率在SU-DHL-4细胞株相较于MINO 中更低，见图1。

图1 不同药物及浓度对MINO 和SU-DHL-4 非霍奇金淋巴瘤细胞增殖的抑制作用

2.2 奈达铂组、吉西他滨组和奈达铂+吉西他滨组细胞凋亡比较 图2 和图3 分别显示奈达铂组、吉西他滨组及奈达铂+吉西他滨组在SU-DHL-4及MINO细胞中诱导凋亡的情况。4 个象限分别代表细胞的不同状态，其中左下角表示正常细胞群，左上角是坏死的细胞群，右上角是早期凋亡细胞群而右下角为晚期凋亡细胞群。在未使用化疗药物处理的对照组中，大多数细胞群落入左下角象限。在SU-DHL-4细胞中，吉西他滨组10%左右的细胞出现早期凋亡，约20%的细胞发生坏死。而奈达铂组和奈达铂+吉西他滨组细胞主要发生晚期凋亡。在MINO 细胞中，奈达铂组、吉西他滨组和奈达铂+吉西他滨组细胞均发生早期和晚期凋亡。

图2 奈达铂和吉西他滨对SU-DHL-4 细胞凋亡的诱导作用

图3 奈达铂和吉西他滨对MINO 细胞凋亡的诱导作用

2.3 奈达铂组、吉西他滨组和奈达铂+吉西他滨组细胞周期阻滞比较 由图4 和图5 可知，对照组的肿瘤细胞一半左右处于G1期。在SU-DHL-4 细胞中，奈达铂组44.5%的细胞处于S 期，吉西他滨组42.2%的细胞处于S 期，奈达铂+吉西他滨组有52.3%的细胞处于S 期。在MINO 细胞中也得到类似的结果，奈达铂组、吉西他滨组以及奈达铂+吉西他滨组的细胞处于S 期的比例增加，其中吉西他滨组的S 期比例最高，达到50.9%。

图4 奈达铂和吉西他滨对SU-DHL-4 细胞周期的作用

图5 奈达铂和吉西他滨对MINO 细胞周期的作用

2.4 奈达铂组、吉西他滨组和奈达铂+吉西他滨组细胞周期蛋白依赖激酶CDK1 和CDK4的表达比较图6 和图7 分别显示对照组和3 个实验组的两种NHL 细胞的CDK1 和CDK4 表达情况，荧光强度越强代表蛋白表达越多。对照组两个细胞株的CDK1和CDK4的表达水平均最高，奈达铂组和吉西他滨组的CDK1 和CDK4 表达降低，奈达铂+吉西他滨组的CDK1 和CDK4的表达量最低，几乎不显示绿色荧光。

图6 奈达铂和吉西他滨调节MINO 细胞CDK1 和CDK4 表达

图7 奈达铂和吉西他滨调节SU-DHL-4 细胞CDK1 和CDK4 表达

3 讨论

本研究使用MINO 和SU-DHL-4 两种非霍奇金淋巴瘤细胞株，通过MTT 实验证实奈达铂和吉西他滨可以抑制两种NHL 细胞株增殖，并且随着药物浓度增加，抑制增殖率也随之增加。两种药物联合使用相较于单一药物抑制细胞增殖效果更加明显。在此基础上，两种药物也可以阻滞细胞周期，使更多比例的细胞发生G2-M 期阻滞。吉西他滨和奈达铂可以诱导NHL 细胞进入早期凋亡和晚期凋亡，而联合组的晚期凋亡比例进一步提高，提示联合用药可以进一步增强肿瘤细胞的凋亡。奈达铂和吉西他滨诱导细胞周期阻滞通过下调CDK1 和CDK4的表达，免疫荧光结果显示，奈达铂联合吉西他滨降低CDK1 和CDK4 表达幅度最显著。

吉西他滨具有细胞周期特异性，主要杀死正在经历DNA 合成（S 期）的细胞，也可以抑制进展细胞通过G1/S 间期。吉西他滨通过其两种活性代谢物抑制DNA 复制和合成的多种作用机制发挥其细胞毒作用[13]。吉西他滨在治疗各类NHL 中进行了广泛的尝试[14-16]。研究显示[17]，在胰腺癌中，吉西他滨可以抑制肿瘤细胞增殖和引起S 期细胞周期阻滞，从而诱导细胞凋亡。本研究中，细胞周期实验显示吉西他滨诱导非霍奇金淋巴瘤细胞发生细胞周期阻滞，对照组细胞占比最高的处于G1期，而吉西他滨和奈达铂处理后细胞周期最高占比由G1期转化为S 期，这提示大部分细胞处于DNA 合成期，而吉西他滨正好作用于这一时期的细胞，发挥抑制肿瘤的作用。吉西他滨联合铂类化疗药物也是经典的治疗方案选择。有研究比较了吉西他滨联合顺铂与吉西他滨联合奥沙利铂治疗NHL的临床疗效，结果表明两个方案的临床有效性相当，但联合奥沙利铂具有更小的副作用和更好的安全耐受性[18，19]。部分临床研究也探索了奈达铂在NHL 中的使用。研究表明[20]，替莫唑胺、奈达铂和长春新碱联合使用治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤具有一定的潜力和安全性。Wang H 等[21]研究显示奈达铂处理耐药细胞后凋亡率明显增加，G2期细胞数也明显增多。本研究探索了奈达铂在NHL 中的机制研究，从细胞周期相关的通路验证了奈达铂可以抑制细胞周期相关蛋白的表达，诱导细胞凋亡。另外，奈达铂+吉西他滨组的研究结果也显示在NHL中奈达铂和吉西他滨具有协同作用，提示两种药物联合治疗NHL 可能会取得更好的效果。

综上所述，本研究从机制层面证实吉西他滨和奈达铂通过下调细胞周期蛋白依赖激酶CDK1 和CDK4的表达，引起细胞周期阻滞，从而诱导非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡，最终抑制细胞增殖，发挥杀伤肿瘤的作用。此外，吉西他滨联合奈达铂的效果优于两者单一药物。