喜树组培苗快速繁殖体系研究

刘慧娟，陶爱群，姜小文

（湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421005）

喜树属于山茱萸目蓝果树科，是中国特有树种和国家Ⅱ级重点保护野生植物，主要分布在长江流域及西南各省[1]。喜树全身是宝，用途广泛，全株含有抗肿瘤作用的生物碱；枝叶含丰富的营养元素，是较好的绿肥树种；果实富含人体必须的不饱和脂肪酸，极具开发价值；木材纤维素含量高，形态好，长度大，花纹美观，油漆后光亮性较好，适于造纸、室内装修等；此外，喜树对二氧化硫、氟化氢等有害气体抗性较强，是常用的园林绿化树种[2]。

野生喜树资源十分有限，无法实现喜树资源综合利用的产业化和规模化。喜树种子易休眠，萌发率低，是喜树人工培育的瓶颈。利用喜树不同部位作为外植体组织培养已有报道[3]，但以种子作为外殖体的培养体系并不完整。本试验以喜树种子无菌萌发为基础，建立种子组培体系，旨在为喜树产业化发展提供所需苗木。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 种子。喜树种子于2019 年11 月采自南岳衡山海拔595 m 处的野生喜树集生地，树龄18 年。采收后阴干，冰箱冷藏。

1.1.2 培养基。本研究以MS、1/2MS、WPM、改良WPM培养基为基本培养基，添加不同的激素，建立喜树组织培养的5组培养基配方，详见表1～表5。

表2 愈伤组织诱导培养基

表3 愈伤组织诱导分化培养基

表4 增殖培养基

表5 生根培养基

以上培养基均添加蔗糖30 g/L、琼脂粉7 g/L，pH 值5.8。

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒与萌芽。将储存待用的种子筛选去掉杂质，去除果皮，留下种胚。使用洗洁精清洗1 次，清水冲洗3 次，75%酒精浸泡30 s，流水冲洗1 h。在超净工作台内将种子放入烧杯中，使用75%酒精浸泡1 min，然后用无菌水冲洗3～4 次；再用10%次氯酸钠溶液抽滤20 min，再用无菌水冲洗3～4 次。将种子接至诱导培养基上，每个处理接10 瓶，每瓶接5 颗种子，3 次重复，放在培养室培养。接种20 天后，观察各个处理的喜树种子萌芽情况。

萌芽率=萌芽数/接种数×100%。

1.2.2 愈伤组织诱导及不定芽分化培养。将种子萌发诱导培养30 天的喜树无菌苗分为根、茎、叶3 个部分，分别接种在愈伤组织诱导培养基上，每个处理接10瓶，每瓶接种5个，重复3次，30 天后统计各个愈伤组织诱导率。将诱导培养30 天的茎愈伤组织接种到愈伤组织诱导分化培养基上，每个处理接10 瓶，每瓶接5 块，30 天后统计不定芽分化率。

诱导率=产愈伤数/接种数×100%

不定芽分化率=分化出不定芽愈伤组织数/接种愈伤组织数×100%

1.2.3 不定芽增殖培养。切取长2～3 cm 的不定芽，接种到不定芽增殖培养基上，每个处理接10 瓶，每瓶接5 个不定芽，重复3 次，30 天后统计增殖系数。

增殖系数=增殖后苗总数/接入苗数

1.2.4 生根培养与练苗移栽。切取长3 cm 以上的无菌苗，接入生根培养基培养，每个处理接10 瓶，每瓶接5 株，重复3 次，30 天后统计生根率。生根良好的瓶苗在3 月炼苗7 天后取出小苗，洗净根部残留培养基，移栽在泥炭土:蛭石:珍珠岩=1:1:1 的基质中。适当遮荫，加强土、肥、水管理，30 天后统计存活率。生根率=生根苗丛数/接种苗丛数×100%存活率=成活株数/移栽株树×100%

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010 软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 无菌外植体培养结果

种子处理接种培养第8 天观察发现，喜树种子开始长出胚根；11 天开始萌芽；20 天长出2 片真叶；30 天后苗高2.5～3.0 cm。

由表6 及图1 可知，以MS 培养基为启动培养基诱导萌发最佳，长势旺且萌发率最高为86.7%。

表6 不同培养基诱导萌芽情况

图1 诱导萌芽结果

2.2 愈伤组织诱导培养结果

由表7 可知，以WPM+NAA0.2 mg/L+BA1.5 mg/L 培养基诱导愈伤组织平均值最高为58.67%；以无菌苗外植体的茎作为愈伤组织诱导最佳，诱导率为82%。

表7 不同培养基愈伤组织培养情况

2.3 愈伤组织分化培养结果

由表8 可知，以WPM+BA1.0 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L培养基诱导愈伤组织不定芽分化诱导率最高为82%，平均不定芽数最高为4.55 个。

表8 不同培养基不定芽分化情况

2.4 增殖培养结果

由表9 可知，不定芽增殖培养最佳培养基为WPM+BA 0.5 mg/L，增殖系数最高为5.8，且平均芽长最长为0.74 cm。

表9 不同培养基不定芽增殖培养情况

2.5 生根培养结果

由表10可知，生根培养最佳培养基为WPM+IBA 0.5 mg/L，生根率最高为88%，平均根数最多为6 条，且平均根长最长为1.26 cm。

表10 不同培养基生根培养情况

2.6 组培苗室外炼苗

由表11 可知，生根良好的瓶苗经过炼苗存活率较高为91%，适合移栽到室外。

表11 炼苗成活率

3 结论与讨论

在喜树组织培养过程中，外植体的选择尤为重要，喜树组织培养所选用的外植体大多采自当地多年生喜树幼苗[4～7]。而喜树种子本身存在休眠现象，所需时间较长，本试验利用种子进行无菌苗诱导，解决了时间长的问题。试验中成功利用当年生喜树种子作为外植体，通过种子灭菌消毒、培养基筛选、激素处理等，建立了喜树愈伤组织诱导、增殖诱导、生根培养和炼苗移栽体系。

本试验中，喜树种子最佳启动培养基为MS 培养基，萌芽率为86.7%；30 天龄喜树试管苗茎在WPM+NAA 0.5 mg/L+BA1.5 mg/L 培养基上愈伤组织诱导率最高，为82%；愈伤组织脱分化不定芽分化最佳培养基为WPM+BA1.0 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L，分化率达82%，每块愈伤组织平均分化芽数4.55 个；不定芽增殖最佳培养基为WPM+BA0.5 mg/L，增殖系数最大为5.8，平均芽长0.74 cm；生根培养最佳培养基为WPM+IBA0.5 mg/L，生根率最高为88%，平均根数6 根，平均根长1.26 cm。移栽至泥炭土:蛭石:珍珠岩=1:1:1 的基质中生长良好，存活率达 91%。本次试验为喜树工厂化育苗提供了关键解决途径。