基于微生物学的速食食品致病菌检验研究

王 辉，张 亮，周美静

（保定市疾病预防控制中心，河北 保定 071000）

目前，食品安全因为与人们的生活和健康息息相关，已经成为全社会广泛关注的热点话题。为了确保食品的安全性，还需要做好相应的微生物检验工作。随着时代的发展，人们的生活水平不断提高，食品的种类也日渐丰富，相应地，食品安全问题也更加受到重视。速食食品具有口味繁多、方便快捷等特点，在人们的日常生活中十分常见，带给大家极大的便利。但是，速食食品也容易受到污染，出现各种致病菌。为此，针对各种速食食品，还需要重视相关的致病菌检验。目前，在检验过程中，可以选择应用不同的检验方法。在本文的研究中，选择200份含有食源性致病菌的速食食品样本进行随机分组，分别采用传统细菌分离培养法和实时荧光定量PCR 法进行检验。通过比较不同检验方法的效果，得出较为合理的检验方案。

1 材料与方法

1.1 菌株及来源

此次实验用标准菌株及其来源于编号情况如表1所示。

表1 实验用标准菌株及其来源于编号情况Tab.1 Source and number of experimental standard strain

1.2 试剂和仪器

此次研究中使用的试剂以及仪器种类分别为：细菌基因组DNA提取试剂盒（广东环凯微生物科技有限公司生产）；PCR 扩增试剂盒（杭州妙丽生物技术有限公司生产）；沙门氏菌核酸检测试剂盒（北京奥博星生物技术有限责任公司生产）；副溶血弧菌核酸检测试剂盒（广州深华生物技术有限公司生产）；金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（上海创坤生物科技有限公司生产）；志贺氏菌核酸检测试剂盒（上海沪震生物科技有限公司生产）；单核细胞增生性李斯特菌核酸检测试剂盒（广州华峰生物科技有限公司生产）；蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒（上海富勒生物科技有限公司生产）；荧光定量PCR 仪（中山大学达安基因股份有限公司生产）；台式高速冷冻离心机（力康生物医疗科技控股有限公司生产）。

1.3 方法

采用传统分离鉴定方式进行检验，包括：前增菌、选择性增菌、平板分离、生化筛选、血清学鉴定。在检验过程中，根据分离培养后不同致病菌的化学组成情况或者代谢产物类型，结合其不同的生理生化等特性，开展生化反应实验，动物毒理实验，溶血实验，对不同的致病菌予以鉴定。

（1）菌株基因组DNA 制备

选取不同培养基上的单个菌落，严格依照不同细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行操作，按照操作流程，将不同菌株的基因组DNA提取出来，提取完毕后，置于-20℃条件下冻存备用，作用是阳性对照。

（2）样本前处理与DNA 提取

对200份速食食品样品进行处理，于无菌条件下，取25.0 g 食品样品均质，将其添加到已经经过灭菌处理的液体培养基（225 mL）中。之后，置于37℃条件下开展增菌培养，连续培养24 h。培养结束后，取50 μL 增菌液进行DNA 提取。针对不同菌株的情况，选择相应的核酸检测试剂盒，严格按照试剂盒说明进行操作，完成检测。

（3）实时荧光定量PCR 反应体系及程序

将食品提取的DNA以及不同菌株的DNA 作为模板，利用特异性引物与探针进行PCR 扩增。研究PCR 扩增梯度循环反应相关循环数与反应时间、反应温度如表2所示。

表2 研究PCR 扩增梯度循环反应相关循环数与反应时间、反应温度Tab.2 The number of relevant cycles, reaction time and reaction temperature of studying PCR amplification gradient cycle reaction

（4）阳性结果判定

在完成反应之后，对结果进行判定。其中，如果待测样品检测所得循环阈值（cyclethreshold,Ct值）小于等于35，且存在明显的指数增长情况，则证明PCR过程中出现目标DNA 的扩增。在空白对照结果、阳性对照结果、阴性对照结果均正常的情况下，可将其判定为阳性。如果检测所得的Ct 值在35~38的范围之内，则需要重新进行PCR 扩增操作。对再次扩增后的外源基因Ct 值进行观察，如果该数值仍然大于35，且存在明显的指数增长现象，在空白对照结果、阳性对照结果、阴性对照结果均正常的情况下，可将其判定为阳性。如果经过再次扩增操作后，外源基因的Ct 值高于38，在空白对照结果、阳性对照结果、阴性对照结果均正常的情况下，可将其判定为阴性。

1.4 观察指标

对两种检验方法下的致病菌阳性检出情况进行统计，相关的致病菌包括计算出总阳性率。并对两组检验所耗费的时间进行记录，计算出平均用时结果。

1.5 统计学处理

对研究过程中采集到的各项数据进行汇总，统一导入到统计学软件 SPSS 21.0中进行出处理。研究中涉及到的各种计量资料均以均数±标准差形式表示，组间的统计学检验采用检验，各项计数资料的表示方法为例，%，组间检验采用卡方检验。检验后实现（＜ 0.05），则证明组间差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同检验方法的阳性检出率统计比较

经统计与组间比较，实时荧光定量PCR 法的样本阳性检出率为11.00%，较传统细菌分离培养法的8.00%明显较高（＜ 0.05），具体统计结果如表3所示。

表3 不同检验方法的阳性检出率统计比较Tab.3 Statistical comparison of the positive detection rate with different detection methods

2.2 不同检验方法的平均用时统计比较

对比不同检验方法下的用时情况，可得实时荧光定量PCR 法的平均用时明显短于传统细菌分离培养法（＜ 0.05），具体统计结果如表4所示。

表4 不同检验方法的平均用时统计比较Tab.4 Statistical comparison of average time with different detection methods±s/h

3 讨论

长期以来，食品安全一直都是备受社会各界关注的重要课题。食源性疾病是公认的、全球首要的食品安全问题，也是首要的公共卫生问题。食品微生物检测的3大指标是菌落总数、大肠菌群、致病菌，食品中常见的致病菌有沙门氏菌，变形杆菌，副溶血性弧菌，致病性大肠杆菌，蜡样芽孢杆菌，肉毒梭状芽胞杆菌等。食品中的致病菌、污染物（真菌毒素）对消费者健康危害较大。近年来，各种致病菌污染所引起的食源性疾病时有出现，严重威胁到公众的健康，也造成了一定的经济损。确保食品安全的关键，在于采取有效的方法，快速筛查受污染的食物。

随着经济的快速发展，生产模式、生产规模甚至消费习惯均发生变化，再加上我国特有的饮食文化，目前，各种不同类型、不同口味的速食食品在人们的生活中十分常见，给大家的日常生活提供了极大的便利。但是，速食食品的制作、加工、包装、运输、贮藏等过程中极易被各种致病菌所侵染，进而影响到食品的质量和安全，并直接威胁到广大消费者的身体健康，甚至是生命安全。为此，针对各种速食食品，应注意从微生物角度出发，重视对其相关致病菌的检验和分析。在具体的检验过程中，可以选择应用不同的检验方法。以往在进行检验的时候，应用的大多是传统细菌分离培养法。应用这一方法进行检验的过程中，需要结合检验需求，对各种致病菌进行培养。培养过程中，不同微生物所需的生长环境条件也各不相同，为获得理想的培养效果，还需要针对不同微生物的特点进行相应的培养基选择和温度、酸碱度控制等等。例如：肠出血性大肠杆菌0157∶H7可以利用与一般大肠杆菌发酵山梨醇的特性不同，在SMAC琼脂上为无色菌落，而一般大肠杆菌为粉红色菌落来鉴别肠出血性大肠杆菌0157∶H7。整个过程操作十分繁琐，复杂，并需要耗费大量的人力、物力。而且，传统培养方法下，对于那些不容易被培养出来的致病菌，往往难以进行检测。另外，检验所耗费的时间也较长。

目前食物致病菌的检查通过增菌培养→分离培养→确认试验，整个过程需要7~14 d的时间，周期长，操作繁琐，已不适应时代发展的需要。因此，开发快速、灵敏的食源性致病菌检测方法至关重要。随着时代的发展，各种新型的检验技术手段开始被开发出来，并逐渐应用到各种食品的致病菌检验之中。聚合酶链式反应（PCR）是一种快速、灵敏、高通量的方法，目前已经被广泛地应用于多种食源性致病菌的快速检测之中。荧光定量PCR(Real-Time PCR）技术即是在PCR反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，对未知模板进行定量分析的方法。具有应用范围广、灵敏度高、操作简便、特异性和可靠性更强、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。细菌的PCR检测流程主要包括核酸提取、扩增和检测，目前，不同的PCR方法，包括常规PCR、实时PCR、多重PCR、免疫PCR和微流控PCR等，均有文献报道应用于各种细菌检测。

在本文的研究过程中，选择应用实时荧光定量PCR 技术。该技术是一种新型的检验技术，传统的检测方法操作繁琐、准确度不高，实时荧光定量PCR方法是基于基因的方法，比传统的检验方法更准确、快速。与传统定量检验不同，传统的检验方法只能进行重点检验，而采用全封闭管分析的实时荧光定量PCR技术可以借助一定的电脑分析软件对PCR 扩增产物的实时动态地进行监测和自动定量分析。在检验过程中，应用该技术，可以根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针，从细胞或特定组织中提取总RNA。之后，使用设计合成的引物，以一定的样品为模板，进行Real Time PCR反应，确认引物模板的反应性能，制作标准曲线，并进行定量分析。在实时荧光定量PCR(qPCR）中，反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累积的扩增量。因此，整个检验和分析的过程十分方便、快捷、高效，极大地提高了检测的效率和精密度以及灵敏度。在本文的研究中，选择应用实时荧光定量PCR技术对速食食品的致病菌情况进行检验。在检验过程中，选择了一些常见的食源性致病菌进行研究，包括蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、志贺氏菌，以及金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等等。在研究中，对所获得的200份速食食品样品进行了检测，检测中应用不同的检测方法，并对检测结果进行了分析。通过分析发现，在样本阳性检出率方面，实时荧光定量PCR 法的样本阳性检出率为11.00%，较传统细菌分离培养法的8.00%明显较高。这一结果表明，与传统细菌分离培养法相比较，应用实时荧光定量PCR法可以更好地对各种阳性标本予以检出，检验的精确度更高。另外，不同检验方法在所消耗时间方面也存在一定的差异。此次研究中，对比不同检验方法下的用时情况发现，实时荧光定量PCR 法的平均用时为（2.35±0.12）h，明显短于传统细菌分离培养法的（37.35±0.15）h。由此可知，实时荧光定量PCR 法是一种高效、方便、快捷的检验方法，在提高检验效果的同时，也可以有效缩短检验所需时间，这对提高实际工作中的致病菌检验效率意义重大。但是，在具体的应用过程中，实时荧光定量PCR 技术、也具有一定的缺陷和不足。例如，该方法的检测的过程中很多因素都可能导致定量结果出现假阳性结果，影响结果的准确性。出现这一情况主要是因为PCR 方法的灵敏度较高，可能会对已经死亡的菌体进行扩增而导致的。另外，该检验方式的整体检测成本较高，在实践中进行大面积推广还存在一定的难度。因此，如何快速有效鉴定各种致病菌，还有待于进一步研究和完善。

4 结语

总之，随着生活水平的提高，在人们的生活中，对食品的质量安全的关注度也在逐渐增强。食品不仅仅是充当着人们营养的主要来源，还是关系到人们生活、工作、学习的重要角色。是消费者和全社会所共同认同和关注的问题之一。所以，对食品的安全监测对个人来说可以有效确保生活质量的不断提高。而如果相关的检测部门采用科学有效的方法，对各类食物进行认真检测，就能够从根本上保证食品卫生的安全。通过本文的分析也了解到，传统的检测方法耗时较长，准确性也偏低，无法满足市场的需求。而应用实时荧光定量PCR 技术则能获得更为理想的检验效果。为此，在今后的食品致病菌检验中，可以积极地尝试对这一方法的推广应用。