金盏菊原生质体对土壤铅/镉响应机制的FTIR, 2D-IR和XPS证据

范春辉, 郑金焕, 刘宏鑫

1. 沈阳师范大学生命科学学院， 辽宁 沈阳 110034

2. Department of Soil and Crop Sciences, Colorado State University, Fort Collins, CO, 80523-1170, USA

3. 陕西科技大学环境科学与工程学院， 陕西 西安 710021

引 言

土壤污染是环境领域的“三大战役”之一， 已发展成全球普遍存在的生态环境问题。 土壤污染能够扰乱生态系统的正常运转， 严重威胁人类生存和农业可持续发展[1]。 作为一个处于快速工业化进程中的发展中国家， 我国的土壤污染总体形势相当严峻。 2016年， 《中华人民共和国土壤污染防治行动计划》(简称“土十条”)正式印发实施， 这为我国土壤污染防治工作提供了技术标准和行动纲领。 随着国家“十四五”规划的实施和“二○三五”远景目标建议的提出， 土壤污染修复将迎来新的历史机遇和挑战。

植物修复法(phytoremediation)通过植物自身吸收、 挥发、 根滤、 降解、 稳定化等行为完成土壤污染物的去除净化， 是现阶段及未来土壤修复主流技术之一[2]。 自1983年Chaney提出植物修复技术至今， 国内外学者对其进行了大量探索性研究， 奠定了植物修复技术理论体系的坚实基础。 金盏菊是最常见的城市草本花卉之一， 兼具药用、 食用和装饰等多维价值。 近年研究初步表明： 金盏菊对土壤重金属也有一定去除效果， 可能会成为土壤修复的潜在植物源[3]。 目前， 相关研究尚处于前期探索阶段， 无法系统提供有说服力的基础数据和参考证据， 对于金盏菊吸收土壤重金属的谱学机制研究亟待加强。

前期笔者建立并优化了金盏菊体内Pb/Cd的检测方法， 明确了金盏菊细胞壁与Pb/Cd的体外接触特性[4]。 原生质体是植物细胞的功能性组分， 其对土壤Pb/Cd的体内响应和结合贡献同等重要。 通过Pb/Cd胁迫土壤盆栽体系获取金盏菊植株样本， 引入差速冷冻离心法提取金盏菊原生质体， 借助XRD， FTIR， 2D-IR和XPS剖析Pb/Cd与金盏菊原生质体结合的反馈信号， 力图从光谱学层面为后续相关研究提供理论支持。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

偏振塞曼原子吸收光谱仪(Z-2000, Hitachi)， X射线衍射仪(D/max2200PC, Rigaku)， 傅里叶变换红外光谱仪(VECTOR-22, Bruker)， X射线光电子能谱仪(ESCALAB 250 Xi, Thermo Scientific)。 实验用水为桶装纯净水， KBr为光谱纯， 其余化学试剂为优级纯。

1.2 盆栽实验

向土壤中均匀喷洒250 mL Pb/Cd混合溶液， 充分搅拌使土壤润湿并混合均匀， 即得Pb/Cd复合污染土壤。 土壤染毒过程包含A(CK)， B， C和D四个处理， Pb/Cd浓度分别为0/0， 200/10， 400/20和600/30 mg·kg-1。 盆栽周期为2016年4月6日至5月20日； 盆栽容器为圆形塑料盆(盆底直径12 cm， 盆顶直径16 cm， 盆高14 cm)， 每盆装有染毒土壤(1.0±0.01) kg； 依次向其中施加尿素(0.4 g·盆-1)、 磷酸二氢钠(0.2 g·盆-1)和氯化钾(0.3 g·盆-1)三种底肥， 每盆播入20粒金盏菊种子， 维持土壤含水量为田间持水量的70%， 于室外天然光照下培养， 之后收获金盏菊植株用于后续使用。

1.3 样品处理

采用差速冷冻离心法分离金盏菊细胞组分， 所有操作均在4 ℃低温下进行。 称取(1.0±0.01) g金盏菊鲜样于预冷研钵中， 加入经4 ℃预冷的10 mL提取剂 [0.25 mol·L-1蔗糖， 50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)] 研磨。 将处理后的匀浆分两次倒入6 mL离心管中离心(10 000 r·min-1， 10 min)， 下层沉淀即为细胞壁及其破碎残渣组分， 其余产品为金盏菊原生质体。 另取一份金盏菊样品装入消煮管中， 向其中依次加入20 mL HNO3和4 mL HClO4， 常温静置12 h后消解样品， 直至白烟基本散尽。 将冷却后的消解液转移至容量瓶， 定容后摇匀检测Pb/Cd赋存形态。 上述所有实验重复三次。

1.4 分析方法

采用Tessier连续提取-AAS法识别实验样品Pb/Cd赋存形态， 其中AAS为空气-乙炔火焰， 乙炔气体压力160 kPa， Pb/Cd测定波长分别为283.3和228.8 nm。 XRD分析为CuKα辐射源， 扫描角度10°～70°， 步宽0.02°。 FTIR检测采用KBr压片法， KBr与样品质量比200∶1， 扫描范围4 000～400 cm-1。 XPS使用带单色器的镁靶(MgKα， 光子能量1 253.6 eV)， 分析室真空度5×10-9Pa， 测试所得的XPS峰以C(1s)(284.8 eV)为基准校正。 利用2D-Shige软件绘制2D-IR谱图， Origin软件处理其他数据并绘图。

2 结果与讨论

2.1 Pb/Cd赋存形态

不同胁迫强度下金盏菊原生质体Pb/Cd赋存形态分布见表1。 原生质体可交换态Pb/Cd所占比重一直不高， 比如在Pb/Cd胁迫强度为600/30 mg·kg-1时(处理D)， 可交换态Pb/Cd分别占其全量的13.54%/29.59%。 随着Pb/Cd浓度的增大， 原生质体有机结合态Pb比重迅速升高， 而各形态Cd含量变化均不明显， 这可能与原生质体内转运体蛋白、 有机酸等组分对Pb/Cd的存贮和解毒机制有关。 此外， Dai[5]之前证实细胞壁对Cd的优先截留效应， 可能也在一定程度上调控了Cd/原生质体的结合。

表1 不同胁迫强度下金盏菊原生质体Pb/Cd赋存形态

2.2 XRD

不同胁迫强度对原生质体XRD图谱的影响如图1所示。 总体上看， 图1(a)中四组图谱差异不大， 具有某些共性特征。 其中， 最强信号均出现在31.7°左右， 代表原生质体系NaCl晶体特征峰[6]； 26.7°和45.5°附近发现若干次峰， 分别鉴定为Pb盐 [Pb5(PO4)3Cl]和Cd盐晶体(CdS)特征峰[7]。 通常认为， 植物体内的盐分(NaCl等)具有维持自身生理代谢、 调控体系水势和渗透势平衡的作用； 植物可能通过摄取较多盐基离子存于体内， 以便缓解重金属毒害和胁迫效应[8]； 而进入原生质体的重金属则常以螯合固定、 胞内沉淀等方式降低活性和毒性。 将XRD图谱局部放大[见图1(b)]， 发现胁迫后谱中29.4°衍射峰几近消失； 这个特征峰代表了含Mg组分的存在， 推测金盏菊在吸收Pb/Cd的同时， 可能发生了离子交换或元素外排等生理响应。

图1 不同胁迫强度下金盏菊原生质体X-衍射光谱

2.3 FTIR

图2 不同胁迫强度下金盏菊原生质体红外光谱

2.4 2D-IR

图3 不同胁迫强度下金盏菊原生质体二维相关红外光谱

2.5 XPS

不同胁迫强度对金盏菊原生质体XPS图谱的影响见图4。 对于A(CK)处理样品， XPS全谱的主要光电子峰分别代表C(1s)和O(1s)， 结合能分别为284.77和532.41 eV。 结合相关文献[13]， 认定C(1s)和O(1s)对应的官能团分别为C—OH和—COOH。 C(1s)和O(1s)都仅出现1个峰， 说明C原子和O原子基本处于同一化学环境。 胁迫反应后， 图谱光电子峰分别为C(1s)， O(1s)， Pb(4f)和Cd(3d)能级的四种元素。 为了深入揭示各元素结合能的变化， 对XPS分谱进行绘制。

图4 不同胁迫强度下金盏菊原生质体X射线光电子能谱

在不同胁迫强度下， C(1s)结合能分别为284.79 eV(处理B)、 284.79 eV(处理C)和284.78 eV(处理D)。 Pb/Cd胁迫导致C(1s)结合能略有增加， 说明胁迫前后原生质体C原子的化学环境变化很小， C原子一定程度上参与了配位反应[14]。 O(1s)结合能分别为532.36 eV(处理B)、 532.70 eV(处理C)和532.68 eV(处理D)， 峰位发生不同程度偏转。 对于处理B， O(1s)峰降低了0.05 eV， 源于O原子在反应过程获得电子， 使自身结合能降低， 这说明酚羟基、 羧基、 内酯基等含O基团参与了反应过程。 对于处理C和处理D， O(1s)的光电子峰分别向高场偏移了0.29和0.27 eV； 边界轨道理论和Pearon软硬酸碱理论认为： 光电子峰由低结合能向高结合能移动， 表明系统势能增大， 系统间发生了软-软作用和电子轨道交叠过程[15]。 据此可知， 本研究中含O官能团对Pb/Cd的结合过程可能涉及多种作用途径。

胁迫反应导致XPS图谱出现Pb(4f)和Cd(3d)光电子峰。 其中Pb(4f)峰定位于133.58 eV(处理B)、 137.78 eV(处理C)和141.38 eV(处理D)附近， 这是π电子-Pb离子相互作用的结果[16]。 Cd(3d)峰分布于402.58 eV(处理B)、 410.68 eV(处理C)和417.68 eV(处理D)附近； 随着胁迫浓度的增加， Cd(3d)结合能逐渐增加， 暗示了反应过程中Cd离子具有明显失电子倾向， 是失电子一方。 图谱中Pb(4f)和Cd(3d)光电子峰识别效果不明显， 可能源于响应信号较弱； 经调整测试条件重复实验后， 基本排除了元素分布不均的情况， 但图谱改进效果仍然很小。 据此认为， 导致信号较差的原因在于原生质体Pb/Cd含量较低。

3 结 论