老年心力衰竭患者血浆中环状RNA的差异性表达

张悦，严光,顾辨辨，孙梦雯，张薇薇，张婉秋

安徽医科大学附属省立医院老年医学科，合肥 230001

心力衰竭是指由多种原因导致的心脏结构或功能异常改变，使心室收缩或舒张功能发生障碍，从而引起的一组复杂的临床综合征，是许多心脏疾病的共同的终末阶段[1-2]。随着人口老年化的推进，心力衰竭的发病率不断上升，已成为老年人住院和病死的主要原因之一[3-4]。早期筛查、诊断和治疗是心力衰竭老年患者预后的重要措施。目前临床上广泛应用的心力衰竭生物标志物如N末端B型利钠肽原存在一定的局限性[5]，新的理想心力衰竭生物标志物有待发掘。环状RNA是一类内源性非编码RNA，具有高度保守、结构稳定、高表达量、组织特异性和发育阶段特异性等优点，有成为生物标志物的潜质[6-9]。多项研究显示环状RNA参与多种心血管疾病过程，且在心力衰竭心肌重构病理变化中具有重要的作用[8,10]。本研究通过检测环状RNA在老年心力衰竭患者血浆中的表达情况，研究其表达谱特征，为进一步研究环状RNA在老年心力衰竭中的作用提供方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020年8月至2021年8月安徽省立医院住院确诊为心力衰竭的老年(大于60岁)患者4例为研究组，患者均符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》[11]的诊断标准；选取同期无任何心血管疾病的健康老年人4例为对照组。所有研究对象均无其他重要器官系统疾病，如糖尿病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肝肾功能障碍、全身性急慢性炎症等。2组对象基本资料进行比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)，见表1。

表1 2组患者的基本资料比较

1.2 研究方法

1.2.1 提取血浆总RNA 所有研究对象均采集外周血5 mL，1 000 r/min离心10 min后分离出血浆，在-70 ℃环境下保存。根据试剂说明书使用TRIZOL试剂盒(Epicentre公司)分别提取研究组和对照组血浆的总RNA，通过检测所提取RNA在230、260和280 nm处的吸光度值来评价总RNA的纯度及浓度。

1.2.2 环状RNA芯片检测 采用Rnase R(Epicentre公司)去除质检合格的样本中的线性RNA，并富集环状RNA，将富集的环状RNA扩增和转录成荧光标记的cRNA(Arraystar公司)，后将标记荧光的cRNA与Arraystar Human circRNA Array V2(Arraystar公司)杂交，Agilent清洗液试剂盒清洗芯片后用Agilent G2505C固定和扫描。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0和R软件进行整理分析。以变化倍数>1.5倍、独立样本t检验的P<0.05为截断点对2组患者之间的环状RNA进行筛选，筛选出差异表达的环状RNA。通过TargetScan和miRanda数据库预测最可能与这些差异表达的环状RNA结合的微小RNA。

2 结果

2.1 原始样本环状RNA表达情况 通过数据的归一化处理后，原始样本中环状RNA表达分布结果显示8份样本中环状RNA表达分布几乎是相同的，可以进行下一步的分析。

2.2 层次聚类分析 根据各组标本中环状RNA的表达谱差异进行监督性层次聚类分析，结果表明2组间环状RNA的表达谱具有明显差异。

2.3 老年心力衰竭患者环状RNA表达谱的差异 将研究组和对照组分析获得的差异性环状RNA绘制成火山图(图1)。比较2组血浆中环状RNA，筛选出差异表达的环状RNA共190种(变化倍数>1.5，P<0.05)，其中表达上调的有116种，下调的有74种。根据变化倍数和P值进行排序的高表达和低表达的前10名环状RNA。

2.4 生物信息学分析 通过TargetScan和miRanda数据库对表达上调和下调的前10名的环状RNA的微小RNA结合位点进行预测，匹配值较高的5个微小RNA见表2、表3。查阅相关文献发现，miR-764、miR-410-3p、miR-483-3p、miR-148b-3p可能与心肌损伤有关，miR-204-5p可能与心肌肥大相关，miR-17-3p、miR-134-5p可能与心肌衰老和凋亡有关，而hsa_circRNA_102228、hsa_circRNA_102227、hsa_circRNA_102225、hsa_circRNA_027610、hsa_circRNA_006240、hsa_circRNA_103327与上述微小RNA存在结合位点，这些环状RNA可能通过靶向吸附上述微小RNA调控老年心力衰竭的发生和发展。

表2 与明显上调的环状RNA匹配值较高的5个微小RNA

表3 与明显下调的环状RNA匹配值较高的5个微小RNA

3 讨论

心力衰竭作为多种心脏疾病的共同的终末阶段，严重威胁着老年人的生命安全[1-4]。而现阶段心力衰竭的早期筛查和诊断仍有许多不足，寻找新的理想心力衰竭生物标志物至关重要。环状RNA是一类不具有5’末端帽结构和3’末端多聚腺苷酸尾结构，由共价键形成闭环结构的RNA分子[12]。环状RNA的高度保守、结构稳定、高表达量、组织特异性和发育阶段特异性等特点，使其具有成为新的生物标志物的可能[6-9]。环状RNA能够作为微小RNA海绵，通过与微小RNA结合降低其活性，阻碍微小RNA对靶基因的抑制作用，从而在疾病的发生发展中发挥作用[13-14]。目前已有多项研究表明环状RNA参与多种心血管疾病发生发展过程，包括在心力衰竭心肌重构病理变化中具有重要的作用[8,10]。环状RNA在老年心力衰竭患者中的临床价值仍需进一步的探索。

本研究通过高通量环状RNA芯片技术检测了老年心力衰竭患者与无任何心血管系统疾病的老年人血浆中环状RNA表达谱。研究结果显示环状RNA在老年心力衰竭患者血浆中的表达与健康对照组差异有统计学意义，差异表达的环状RNA共190种(变化倍数>1.5，P<0.05)，其中在老年心力衰竭患者血浆中表达上调的有116种，下调的有74种，这提示环状RNA可能与老年心力衰竭的发生发展具有一定的相关性。查阅相关文献后发现，miR-764、miR-410-3p、miR-483-3p、miR-148b-3p可能与心肌损伤有关[15-18]，miR-204-5p可能与心肌肥大相关[19]，miR-17-3p、miR-134-5p可能与心肌衰老和凋亡有关[20-21]，而本研究筛选出的差异性表达的hsa_circRNA_102228、hsa_circRNA_102227、hsa_circRNA_102225、hsa_circRNA_027610、hsa_circRNA_006240、hsa_circRNA_103327与上述微小RNA存在结合位点，这些环状RNA可能通过靶向吸附上述微小RNA参与调控老年心力衰竭的发生和发展。

综上所述，环状RNA在老年心力衰竭患者血浆中的差异性表达揭示了环状RNA可能与老年心力衰竭的发生发展具有一定的相关性。环状RNA可能通过作用于微小RNA参与了心力衰竭病理过程的发生发展。另外，本文研究中纳入的样本量较小，对于这些差异性环状RNA在老年心力衰竭患者中的具体表达水平还需要在大样本量的病例及分子机制研究中进行确认。