基于网络药理学和分子对接探讨斑蝥复方制剂治疗宫颈癌的作用机制#

文静 刘霜飞 丁逸 徐琴 王杉 周晴 罗宇航 魏莹

（1.川北医学院药学院，四川 南充 637100；2.川北医学院临床医学系，四川 南充 637100；3.川北医学院基础医学院，四川 南充 637100）

宫颈癌主要由感染人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）引起，是最常见的妇科恶性肿瘤，该病死亡率高，且发病率呈逐年上升趋势，是全球面临的一项重大公共卫生挑战[1]。目前临床常采用以手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗方案[2]。中医药具有多靶点、多途径、多环节以及整体调控的特点，对HPV的治疗具有一定的优势，临床实践表明，治疗HPV中药方剂的成方规律为抗癌解毒药与补气药为主，补血药与活血化瘀药为辅[3]。

斑蝥复方制剂具有扶正祛邪、抗肿瘤和免疫调节作用[4]，在临床主要与手术、化疗联合使用起到临床辅助治疗的效果，增强抗癌作用，减轻化疗药物的毒副反应。

本研究基于网络药理学方法[5]联合分子对接技术研究斑蝥复方制剂的活性成分及潜在作用机制，以期为后续斑蝥复方制剂治疗HPV的体内外研究及新药的开发提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 斑蝥复方制剂活性成分和潜在作用靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），以斑蝥复方制剂主要组成药物斑蝥、黄芪、人参为关键词检索TCMSP数据库，并以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18为筛选条件，获取药物的主要活性成分。利用Uniprot数据库对靶点进行标准化处理，获取相应的基因名称、基因ID。

1.2 疾病靶点的获取及疾病-药物靶点的Venn分析

以“Tumors or cancer of the UTERINE CERVIX”和“Uterine Cervical Neoplasms”为关键词，挖掘genecards（https://www.genecards.org）、OMIM（https://omim.org/）两大数据库中的潜在靶点。以Relevance score≥15筛选得到疾病靶点。将疾病靶点与药物靶点同时导入BioVenn（http://www.biovenn.nl/index.php）获取交集靶点。

1.3 蛋白质相互作用网格（PPI）的构建和关键靶点的分析

将交集靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/）构建PPI网格模型，设置生物种属为“Homo sapiens”，最低相互作用评分为“highest confidence(>0.900)”。使用Cytoscape3.8.2可视化，利用CytoNCA对网格进行拓扑分析。

1.4 生物功能与通路分析

将交集靶点导入Metascape平台进行GO功能和KEGG通路分析，在生物信息学平台（http://www.bioinformation.com .cn/）上绘制GO和KEGG富集分析的气泡图进行可视化。

1.5 “药物-成分-靶点-通路”网格的构建

以3种中药、34种活性成分和110个交集靶点与显著富集的20条通路为原数据，应用Cytoscape3.8.2构建“药物-成分-靶点-通路”网格并隐藏无相互作用的节点。

1.6 活性成分与靶点的分子对接验证

利用AutoDock Tools 1.5.6进行分子对接，以验证其相互作用活性。从TCMSP下载活性成分的mol2格式文件。在PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中下载核心靶点的3D结构，通过Pymol软件执行去水、加氢等操作。运用AutoDock程序进行分子对接并计算结合能，对接结果采用Discovery studio进行可视化。

2 结果

2.1 复方斑蝥制剂活性成分与药物靶点的预测

在TCMSP数据库检索出斑蝥、黄芪、人参的活性成分，经过OB≥30%和DL≥0.18的限定，再剔除无对应靶点的成分，最终得到34种活性成分。其中斑蝥1种，人参和黄芪各17种，合并去重，最终确定211个药物靶点，见表1。

表1 斑蝥复方制剂候选化合物信息表

2.2 疾病-药物靶点的获取

经GeneCards、OMIM两大数据库筛选去重，共获取1218个宫颈癌相关靶点。疾病-药物靶点进行韦恩分析后，获得110个交集靶点，见图1。

图1 斑蝥复方制剂药物靶点与疾病靶点的交集分析

2.3 PPI网格分析

度值越高的靶点越接近同心圆的中心，其体积越大。靶点重要性与度值成正相关，分析十个核心靶点，如表2。TP53度值最高，能与34个靶点相关联。其次是AKT1，与32个靶蛋白相关联。

表2 斑蝥复方制剂治疗宫颈癌的主要靶点及拓扑参数

2.4 GO和KEGG富集分析

以P≤0.001为参考标准，GO富集分析得到367条生物过程，18项分子功能相关，4项细胞组成相关。图2列举了富集最显著的10个条目。GO分析中生物过程主要涉及对无机物的反应、凋亡信号通路等。细胞组成涉及转录调节因子复合物、受体复合物等。分子功能主要涉及DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合等。

图2 斑蝥复方制剂抗宫颈癌交集靶点的GO功能富集分析

KEGG富集分析以P≤0.01为参考标准，共富集得到256条通路，图3列举了P值排名前20的富集通路。人类疾病相关通路、炎症和免疫相关通路、内分泌代谢通路均参与宫颈癌的病理发展。癌症通路，IL-17信号通路，PI3K-Akt信号通路均与较多核心靶点相关联，推测其在宫颈癌的潜在治疗机制中发挥着重要作用。

2.5 “药物-成分-靶点-途径”网络分析

药物-成分-靶点-途径网络如图4所示。据网格分析，主要靶点为PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、RELA、AKT1等。槲皮素作用于76个靶点，是复方斑蝥制剂治疗宫颈癌最主要的活性成分。癌症途径和PI3K-Akt信号通路是最主要的两个信号通路。暗示出斑蝥复方制剂治疗宫颈癌的多组分、多靶点、多通路特点。

2.6 分子对接

“药物-成分-靶点-通路”网格图中度值排名靠前的6种活性成分与PPI网格中度值较高的7个靶点进行分子对接，结果见图6。一般认为，结合能越低，分子结构越稳定。对接结果显示，β谷甾醇与HSP90AA1的结合能最低，为-6.13KJ▪mol-1。其次是JUN和异鼠李碱，结合能为-5.86KJ▪mol-1。β谷甾醇和芒柄花素与多个靶点均有较好的结合能力，JUN和HSP90AA1是结合能力最显著的靶点。分子对接构象和相互作用见图5。

图6 结合自由能的热图

3 讨论

斑蝥复方制剂多由斑蝥、人参、黄芪、剌五加等中药组成，临床已使用多年。斑蝥在古代已有使用，但其毒性甚大，应用受到限制[6]。如今先进的现代技术使得斑蝥复方制剂的抗肿瘤效果得到了广泛的认同[7-9]。

临床研究表明，斑蝥素可减弱Hela宫颈癌细胞迁移和侵袭[10]，宫颈癌患者应用复方斑蝥胶囊联合化疗，能显著提高患者生命质量[11]等。本研究运用网络药理学方法，初步探讨斑蝥复方制剂各成分在机体分子层面的生物靶点，推测药物的效应机制，阐释其抗宫颈癌的作用机制。

本研究选择了斑蝥复方制剂中的斑蝥，人参，黄芪三味主要药物进行分析，推测槲皮素、山奈酚、β谷甾醇等为治疗宫颈癌的核心成分。槲皮素（Quercetin）具有良好的抗肿瘤活性[12]，可不同程度地抑制宫颈癌Hela细胞增殖，且呈时间和浓度依赖性[13-14]。山奈酚（Kaempferol）能抑制ERK/MAPK通路和PI3K-AKT通路诱导肿瘤细胞凋亡[15-16]，这也与本研究结论相映衬。而β谷甾醇（beta-sitosterol）能通过介导AMPK、PTEN和HSP90发挥抗肿瘤作用[16]，其抗宫颈癌的栓剂已经用于临床[17]。

本研究得到了斑蝥复方制剂治疗宫颈癌的核心靶点，包括TP53、HSP90AA1等。李志强等研究发现TP53的表达特点在宫颈癌的术后复发中有重要的预测价值[18]。同时TP53调控通路中P53基因单核苷酸多态性与HPV相关宫颈癌遗传易感性相关[19-20]。本研究显示，两大网格中HSP90AA1均具有很高的度值，其与多个活性成分均有较低的结合能。研究表明，宫颈癌组织中检测到高水平的Hsp90[21]，且抑制Hsp90可有效诱导宫颈癌细胞凋亡[22]。

通过GO功能和KEGG通路富集分析，本研究发现靶点参与多种生物过程来抑制宫颈癌细胞的增殖、分化，促进细胞凋亡。KEGG通路主要富集于癌症相关途径、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路。Simone Punt指出Tregs和IL-17+细胞数量少与宫颈癌特异性生存率低相关[23]，Th17细胞和IL-17在高危HPV感染中，可起到增强免疫力的作用[24]。而PI3K/AKT/mTOR途径被认为是一个有前途的抗癌治疗靶点，在病毒/宿主细胞串扰中起关键作用[25]。

本研究运用网络药理学方法探讨了斑蝥复方制剂治疗宫颈癌的活性成分、靶点以及作用机制，为后续斑蝥复方制剂治疗宫颈癌的分子机制及新药的开发提供新的思路。但由于数据库的数据在不断更新，部分数据尚不全面，不能覆盖所有中药、靶点、通路。所以本研究结论尚有一定的局限性，其具体机制还需更深入的研究。