慢性呼吸道感染患者呼吸道分泌物分离奈瑟菌的cppB 与pJD1 基因检测

唐利亚，李杰，严洁

（1永州职业技术学院，湖南 永州 425100；2永州职业技术学院附属医院，湖南 永州 425100 ）

0 引言

奈瑟菌是临床呼吸道感染患者呼吸道中常见的正常菌种，相对于淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌而言，这些正常菌群缺乏菌毛及外膜蛋白质这样的致病相关因素通常对人体不会产生致病性[1-2]。但是存在于慢性呼吸道感染患者呼吸道中的有些奈瑟菌可能会对患者造成继发性感染或对男性患者的生殖系统造成感染，这可能对患者原发疾病的诊断造成一定影响，造成误诊或漏诊发生[3-4]。cppB与pJD1基因检测在对淋病奈瑟菌的检测中具有明显的特异性反应因此成为快速鉴别淋病奈瑟菌和诊断淋病的常用检测手段，但近年来有学者指出该检测方法对存在细胞壁缺失的奈瑟菌存在漏检的情况因而对其临床检测价值不予支持。本研究对我院收治的98例慢性呼吸道感染患者进行痰标本分离，对不同的奈瑟菌检测结果进行分析，详细报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2018年5月-2019年5月在我院接受治疗的98例慢性呼吸道感染患者作为菌株来源，对患者进行痰标本菌株分离。标本来源患者中共有男47例，女51例，其中慢性支气管炎患者有26例，年龄12～31岁，平均（25.62±4.32）岁；支气管扩张伴感染患者有24例，年龄10～59岁，平均（45.62±3.67）岁；支气管哮喘患者有32例，年龄9～27岁，平均（19.66±3.52）岁；肺癌伴感染的患者有16例，年龄15～26岁，平均（18.67±4.22）岁。所有痰液标本中共分离出奈瑟菌株368株，菌种9种。其中浅黄色奈瑟菌25株，微黄奈瑟菌46株，干燥奈瑟菌37株，嗜乳糖奈瑟菌48株，黏液奈瑟菌26株，多糖奈瑟菌52株，灰色奈瑟菌65株，脱氨奈瑟菌49株以及淋病奈瑟菌20株。98例患者痰液标本检出奈瑟菌菌种分布情况，详见表1。

表1 检出奈瑟菌菌种分布情况[n(%)]

1.2 检测方法

（1）试剂与仪器选择。缓冲液、dNTPs、MgCl2以及Taq DNA聚合酶均产自北京索莱宝科技有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒以及DNA标志物购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，琼脂糖、TBE缓冲液、ED-TA购自金克隆（北京）生物技术有限公司，PCR仪型号为KS48+，购自冠森生物科技（上海）有限公司，凝胶成像使用E-Gel Imager凝胶成像仪进行观察，荧光定量PCR仪型号为Q2000B，购自上海般诺生物科技有限公司。

（2）基因检测。使用cppB特异性引物对各菌株染色体DNA提取物进行PCR扩增，其反应条件为95℃预变性10min，95℃变性60s，55℃退火40s，72℃延伸10min，用5μL的扩增产物对1%琼脂糖进行凝胶电泳，使用溴化乙锭进行染色处理后对凝胶成像系统结果进行观察记录。

pJD1检测使用淋球菌核酸扩增荧光检测试剂盒进行检测，检测严格按照试剂盒推荐方法进行。

2 结果

对分离出的奈瑟菌属菌种进行检测，共有90株奈瑟菌检出cppB阳性占比为24.46%，51株检出pJD1阳性，占比为13.86%。其中cppB检测干燥奈瑟菌与黏液奈瑟菌检出率均为100%，淋病奈瑟菌cppB与pJD1检测均表现为阳性反应。368株奈瑟菌cppB与pJD1基因检测结果，详见表2。

表2 奈瑟菌cppB与pJD1基因检测结果[n(%)]

3 讨论

奈瑟菌属是格兰阴性双球菌，是β-变形菌类中的一种无芽孢，无鞭毛，有菌毛，专性需氧，氧化酶阳性细菌[5]。奈瑟菌形状酷似球形，通常两两成对排列，形状类似咖啡豆，通常该菌种位于人体中性粒细胞内，而在人体患有慢性淋病时常位于细胞外，新分离的菌株有荚膜和菌毛。奈瑟菌属包括脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、干燥奈瑟菌、微黄奈瑟菌、浅黄奈瑟菌、黏液奈瑟菌等多种菌株，其中能够引起人体发病的只有脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌两种，通过标本图片检测就能够在显微镜下清晰观察到中粒细胞内存在的脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌成双排列[6-7]。除了这两种奈瑟菌，其他奈瑟菌通常寄生在人体呼吸道中，多存在于细胞之外，为正常菌群。正常菌群由于其缺少重要的致病性菌毛与蛋白质对人体不具有致病性，但是仍然能够通过对人体呼吸道造成影响使其产生继发性感染或对男性生殖器官造成感染，在临床检查中常常会因为这些正常菌群造成误诊或漏诊，对患者及时有效的治疗造成了一定的影响[8]。奈瑟菌的致病物质主要有荚膜、菌毛以及内毒素，荚膜具有抗吞噬细胞的吞噬作用，菌毛有助于细菌附着于细胞表面，利于进一步侵入人体组织。内毒素是主要致病物质，由细菌自溶或裂解释放，可使小血管、毛细血管形成血栓引起出血，严重时造成DIC、中毒性休克。致病性的奈瑟菌能够通过呼吸吸入的飞沫传播，也可通过被患者呼吸道分泌物污染的日常或医疗用品而感染。潜伏期最长可达10天，因此容易被人们忽视。病菌集中在鼻咽部进行繁殖，之后侵入血流，进而引起菌血症或败血症。出现该类感染患者通常会出现恶寒、高烧、恶心、呕吐、皮肤或黏膜出现出血点或出血斑等临床症状。如果细菌通过血脑屏障到达脑脊膜，产生化脓性炎症，病人则表现为剧烈头痛、喷射状呕吐、颈项强直等脑膜刺激症状。暴发型流脑起病急且十分凶险，若未能进行及时抢救就可能导致患者死亡。因此对患者采取有效的鉴定方式尽早发现其致病风险所在对提高临床治愈率，减少患者发病风险甚至是死亡率具有明显作用。一般来讲，如果急性呼吸道感染无法得到彻底治疗就可能发展成慢性呼吸道感染疾病，慢性呼吸道感染疾病没有急性呼吸道感染发病时的明显特征及表现，因而通常会被人们忽略，因而耽误治疗，导致病情进一步恶化[9-10]。对慢性呼吸道感染患者分泌物中的奈瑟菌行cppB与pJD1基因检测是考虑到这两种检测方式对淋病奈瑟菌的特异反应明显因而能够对患者存在的潜在患病风险进行尽早发现并给予针对向治疗，对减少患者患病风险及提升公共卫生安全均具有明显作用。尤其是儿童患者群体由于其自身免疫能力低下，容易遭受病菌感染，一旦淋病致病原菌造成了患者感染就容易造成其泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性感染并存在传染性风险。

本研究结果中从慢性呼吸道感染患者痰液中分离出了9种致病菌，经过分别对几种菌株进行cppB及pJD1基因检测，结果显示其中cppB基因检测对微黄奈瑟菌和黏液奈瑟菌的检出率最高，而淋病奈瑟菌在cppB及pJD1检测中均表现为阳性反应，检出效果明显。淋病奈瑟菌在人体中位移对泌尿生殖系统造成感染的奈瑟菌属菌种，临床上通常利用其培养特性对染色体形态进行观察或利用氧化酶试验等方法对其进行检测以检出其是否存在或对淋病进行诊断。cppB及pJD1基因检测也是检测淋病奈瑟菌的常用方式且具有较高的检出率，对尽早发现患者患病风险，进行积极应对具有重要作用。此外本研究结果证实cppB及pJD1基因检测并不仅仅对淋病奈瑟菌具有特异性，对浅黄奈瑟菌、微黄奈瑟菌、干燥奈瑟菌、嗜乳糖奈瑟菌、黏液奈瑟菌及多糖奈瑟菌进行cppB基因检测均有阳性反应，其中干燥奈瑟菌和黏液奈瑟菌的检出率达到了100%。对微黄奈瑟菌、嗜乳糖奈瑟菌、黏液奈瑟菌、多糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、脱氨奈瑟菌进行pJD1检测也存在阳性反应，其中黏液奈瑟菌和脱氨奈瑟菌的检出率相对较高。说明cppB及pJD1基因检测的特异性在其他奈瑟菌菌种中都广泛存在，具有较高的临床应用价值，对提升临床诊断的准确性和早期诊断具有重要意义。

综上所述，慢性呼吸道感染患者呼吸道中存在的正常奈瑟菌群也会引起患者泌尿生殖系统感染，可能引起尿道炎等疾病。对正常奈瑟菌进行cppB及pJD1基因检测时也会出现较为明显的反应，因此在临床诊断中需要对患者进行病原体分析联合常规细菌检测提高诊断的准确性。