厂形叶幕赤霞珠葡萄果实苹果酸的代谢规律

周晓明，张付春，钟海霞，张 雯，韩守安，伍新宇，潘明启

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】酒石酸与苹果酸是葡萄果实中最重要的有机酸，是转色期前葡萄浆果中积累的主要可溶性有机成分，两者占浆果总酸的70%～90%[1]。葡萄果实中酒石酸的积累代谢相对稳定。苹果酸积累与分解受环境因素影响较大，特别是转色期前后及成熟期的气候条件[2]。新疆葡萄栽培产区存在成熟期短且气温较高等现象，导致酿酒葡萄的酸度相对偏低。研究葡萄果实中苹果酸等有机酸的代谢规律，对葡萄品质调控技术的改良有重要意义。【前人研究进展】苹果酸(malic acid, malate)是一种四碳二羧酸,参与许多细胞代谢, 还作为碳素和还原力载体在细胞质与细胞器以及细胞器之间传递碳素和还原力。转色前期苹果酸的积累主要依靠糖代谢转运至浆果内以及潜在的浆果光合作用生成[3]。转色后期苹果酸从液泡中释放出来并参与各类分解代谢反应，包括TCA循环、呼吸作用、糖异生反应、氨基酸互化、乙醇发酵，以及产生系列复杂的此生代谢产物如花色苷和黄酮醇[4-6]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)、苹果酸酶(NADP-ME)是果实参与苹果酸代谢的3种关键酶[7-9]。PEPC能利用碳酸根将PEP缩合成OAA。其活性在浆果发育早期一直保持较高水平，其变化与苹果酸含量积累变化相一致，在浆果成熟开始之前其活性迅速降低。MDH能催化OAA与苹果酸之间的可逆反应，并维持二者之间的平衡。ME能够降解苹果酸并将其脱羧变为丙酮酸，催化二者的可逆反应，在葡萄[10]、苹果[11]、梨[12]等果实上的研究结果表明，NADP-ME活性与苹果酸含量呈负相关。对樱桃[13]、欧洲李[14]的果实发育研究，均表明NAD-MDH和NADP-ME 活性分别与苹果酸含量呈极显著的正、负相关，其共同作用造成了不同品种果实中苹果酸的积累差异。叶幕形对葡萄果实的品质有较大的影响。不同的叶幕高度[15]、厚度处理[16]，可以改变葡萄的光合作用效率及果实生长区域微气候环境，影响葡萄的果实品质。杨君[17]比较了直立叶幕和V形叶幕下赤霞珠葡萄的果实品质，发现V形叶幕果实着色较好，单株产量、可溶性固形物含量以及果皮的总黄烷醇、总花色苷含量均高于直立叶幕。【本研究切入点】在厂形树形的基础上进行简约化的叶幕形处理，从而达到调控葡萄果实苹果酸代谢方面的研究至今鲜有报道。需研究不同叶幕形果实苹果酸等有机酸的积累代谢及苹果酸相关代谢酶活性的变化规律。【拟解决的关键问题】在厂形树形的基础上，设置对照直立形叶幕及2种高度的厂形叶幕，研究叶幕微气候调控对赤霞珠葡萄果实苹果代谢的影响及作用规律，为酿酒葡萄品质的精准化调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

采样地点位于新疆乌鲁木齐市新疆农业科学院安宁渠试验场。葡萄为单主干树形厂形架势，2011年定植，南北行向，株行距1 m×3 m。

2017年7月19日～9月8日采样。每隔10 d采样1次，分别为葡萄盛花期后35 d(7月19日)、45 d(7月29日)、55 d(8月8日)、65 d(8月18日)、75 d(8月28日)、85 d(9月7日)、95 d(9月18日)。

每个单株分东西面各选2个果穗，从1个果穗的上、中、下共采5～8粒果实，混合样分3份即为3个重复。果实采摘后立即用冰盒带回实验室，液氮速冻，破碎去除种子，于-40℃保存待测。

1.2 方 法

1.2.1 叶幕处理

盛花期后25 d(2017年7月9日)，在厂形树形架势的基础上，设置顶端向西侧生长型厂形叶幕H1及H2，二者顶端叶幕分别为距地面1.5 m及1 m。CK为对照处理，即直立形叶幕，顶端叶幕高度1.2～1.5 m。每种叶幕处理10株葡萄。3种叶幕形树体生长过程简约化修剪，保持叶果比相对一致，尽可能减少其他因素的交互影响。图1

图1 3种叶幕形示意Fig.1 Schematic diagram of three canopy types

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 酸组分

采用HPLC方法并参考林耀盛[18]的方法并进行优化。

检测仪器及色谱条件：岛津LC-20A高效液相色谱仪(配紫外检测器)，Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)。流动相为甲醇与0.01 mol/L磷酸氢二铵缓冲液(3:97，磷酸调整pH=2.6)，检测波长210 nm，柱温25℃，流速0.5mL/min，进样量10 μL。酒石酸、苹果酸、柠檬酸在10 min内出峰完成。

1.2.2.2 酶活性

酶液的制备参照Hirai[19]及史娟[20]的方法。取3 g果肉用3 mL 研磨液在冰浴下研磨(4℃)，4 000 r/min离心20 min，取上清液定容至5mL，加入等体积(5 mL)提取液，即得NAD-MDH和NAD-ME 酶液，取4 mL在提取缓冲液中4℃透析过夜，即得PEPC 酶液。各项操作均在 0～4℃下进行。研磨缓冲液：0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.2，0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L异抗坏血酸。提取缓冲液：0.2 mol/L Tris-HCl，pH8.2，10 mmol/L 异抗坏血酸，0.1% TritonX-100。

酶活性测定参考Hirai[19]及罗安才[21]等的方法。酶活性以U/(min·g)FW表示。

1.2.2.3 其他成分

果域微环境温度：分别在3种叶幕处理的葡萄结果区域放置高精度温度测量仪(路格L90-1)，每1 h记录1次温度变化。当地气象站所测气温的日均温度作为环境温度以作参照。

总酸(TA)：参照国际《GB/T 12456-2008 食品中总酸的测定》的方法，结果以酒石酸计。

可溶性固形物(TSS)：ATAGO PAL-1数显糖度计测定。

1.3 数据处理

利用SPSS 26.0对数据进行分析。使用Origin2020作图。

2 结果与分析

2.1 果域微环境的温度变化

研究表明，温度变化为CK>H1>环境温度>H2。环境温度、CK、H1、H2的均温分别为 23.3、24.2、23.4和22.7℃。CK的果域温度高于环境温度和其他处理。H1的果域温度比CK低0.8℃，H2果域温度比CK低1.5℃，H1的果域温度比H2高0.7℃。

H1与H2的叶幕处理一定程度上起到了降低果域温度的效应。H1果域温度高于H2。图2

图2 果域微环境的温度变化Fig.2 Temperature change of the fruit-zone microenvironment

2.2 不同叶幕形有机酸含量变化

研究表明，L-酒石酸与L-苹果酸在花后35～85 d的过程呈现持续下降趋势，花后45～55 d变化幅度最为剧烈，该时段也是赤霞珠葡萄的转色期。花后95 d L-酒石酸含量极小幅度的增高可能与成熟末期果实失水有关。赤霞珠果实的柠檬酸含量较低，在果实发育过程中呈现不规则变化，H1处理在较小范围有含量略高于其他处理的趋势。

成熟过程果实可溶性固形物含量呈现持续上升趋势，在转色期出现较大幅度的上升。酒石酸与柠檬酸占到总酸的82%～95%，二者是葡萄果实最主要的有机酸。总酸含量的变化趋势与这2种酸的含量变化也基本一致。

CK处理的葡萄果实酒石酸、苹果酸含量整体下降的幅度大于H1与H2处理。花后95 d，H1、H2处理的酒石酸含量分别为4.684、4.670 mg/g，比CK处理分别高0.774、0.760 mg/g；H1、H2处理的苹果酸酸含量分别为1.038、1.065 mg/g，比CK处理分别高0.338、0.365 0 mg/g。H1与H2的叶幕处理与CK相比，一定程度上提高了果实酒石酸与苹果酸的含量，成熟过程H1处理的果实酒石酸与苹果酸含量整体呈现略高于H1的趋势，但差别极小。花后95 d H2处理果实苹果酸含量呈现高于H1的情况，但也仅为0.027 mg/g。图3

图3 不同叶幕形葡萄果实有机酸含量变化Fig. 3 Changes of organic acids in grape fruits with different canopy types

2.3 不同叶幕形苹果酸代谢相关酶活性的变化

研究表明，果实PEPC酶活性在成熟过程整体呈现下降的趋势。该酶参与的苹果酸合成的作用可能逐渐减弱。

果实NAD-MDH酶活性在成熟过程也整体呈现下降趋势。45～55 d时，大幅度的下降，该时期是赤霞珠葡萄转色的关键时期。此时期的果实苹果酸含量也有较大幅度的下降，该酶活性的降低可能对苹果酸合成有较大影响。

NADP-ME酶活性在果实成熟过程中前期呈现较明显的上升趋势，中后期出现小范围的下降。该酶与苹果酸的分解有关，转色期赤霞珠果实苹果酸较大幅度的下降与该酶在这一阶段的变化有较一致的正相关趋势。图4

2.4 苹果酸代谢相关酶活性与苹果酸含量及果域温度变化的相关性

研究表明，CK处理与PEPC酶活性、H2处理与NAD-MDH酶活性达到极显著正相关。CK处理与NAD-MDH酶活性显著正相关，与NADP-ME酶活性显著负相关。H1处理与PEPC酶活性及NAD-MDH酶活性显著正相关。CK处理与苹果酸合成代谢酶的相关性较好。表1

表1 苹果酸相关代谢酶活性与苹果酸含量相关性Table 1 Correlation between malate-related metabolic enzyme activity and malate content

阶段性温度变化与3种酶活性变化无显著相关性。NAD-MDH与温度的正相关性较高，NADP-ME与温度呈现一定的负相关性。低温可能不利于NADP-ME的活性升高，低温带来的效应可能是减弱苹果酸的降解。表2

图4 不同叶幕形葡萄果实苹果酸代谢相关酶活性变化Fig. 4 Changes of enzyme activities related to malate metabolism in grape fruits with different canopy types

表2 苹果酸相关代谢酶活性与果域微环境温度相关性Table 2 Correlation between the activity of malate-related metabolic enzymes and the temperature of the fruit-zone microenvironment

3 讨 论

新疆地区的葡萄栽培需要进行埋土防寒，在厂形树形的基础上，改变顶端的部分叶幕为西向厂形叶幕，在简约化的基础达到了对底部果实的部分遮阴效果，一定程度上改变了果域微环境的温度。东西双向的V形叶幕也是改变果域微环境及树体光合效应[22]的手段之一，但V形叶幕从结果部位以上的叶幕中底部开始改变叶幕形，操作相对较复杂。葡萄是喜阳光的植物，除了叶片的光合效应，果实表面的光照对成分积累及代谢也有较为重要的作用[23]。V形叶幕遮阴作用较强，过早布置还会对果实有机酸等物质的积累产生不利影响[24]。设置西向的厂形叶幕，可以有效降低午后的日照高温对果域微环境的影响，东向果实仍可接受清晨及上午较为温和的日光。较早的果实部分遮阴，对有机酸及其他成分积累的影响仍需深入研究。

叶幕形的调整在一定程度上达到了调控苹果酸等有机酸代谢的目的。PEPC、NAD-MDH、NADP-ME 3种苹果酸代谢相关酶变化与苹果酸含量变化呈现出的相关性也与前人[10,25,26]的研究相吻合。3种代谢酶与果域温度呈现出不同的相关性，但并未达到显著水平，果实中苹果酸的代谢可能受更复杂因素的影响。关于不同叶幕造成的树体光合效应的改变以及不同光照温度对果实光合物质代谢的影响，研究并未涉及，需要今后进一步的深入研究。

葡萄果实酒石酸的积累代谢虽然相对稳定[27]，但是试验中发现叶幕形的改变对酒石酸含量可能起到了一定的调控作用。葡萄中柠檬酸含量较低，其代谢可能受多方因素影响[28]，试验中的叶幕处理对其代谢的影响规律并不十分明确。

4 结 论

厂形叶幕与直立形叶幕相比，降低了赤霞珠葡萄果域微环境的温度，2种厂形叶幕处理分别降低了0.8℃与1.5℃。厂形叶幕在一定程度上提高了酒石酸与苹果酸的含量，2种厂形叶幕处理的葡萄果实酒石酸含量分别提高了0.774与0.760 mg/g，苹果酸含量提高了0.338与0.365 mg/g。3种叶幕下，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶与果实苹果酸含量呈现不同程度的正相关，苹果酸酶与果实苹果酸含量呈现不同程度的负相关。果域微环境温度与3种酶未达到显著相关。厂形叶幕处理可以在一定程度上提高赤霞珠果实的有机酸含量，H1高度处理可能是增高果实苹果酸等有机酸含量的更有利选择。