硫氧还蛋白互作蛋白的生物信息学预测

靳文文，李文龙，张志楠，焦向英

山西医科大学基础医学院生理学教研室，山西太原 030001

硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）首次发现于1994年，最初命名为维生素D3上调蛋白-1（vitamin D3 upregulation protein-1，VDUP-1），是一种经1，25-二羟基维生素D3刺激人类急性髓系白血病HL-60细胞，并以获得的mRNA构建cDNA文库，从中分离VDUP1 cDNA，于体外表达产生的蛋白［1-2］。传统观点认为，TXNIP是一种有效的肿瘤抑制因子，在各种类型的人类癌症中表达均降低［3-4］；近年研究发现，TXNIP具有多效性作用（包括调节β细胞功能、肝葡萄糖生成、外周葡萄糖摄取、脂肪生成和底物利用），成为葡萄糖和脂质代谢的重要调节剂［2-5］。生物信息学（bioinformatics）是由生命科学及计算机科学相结合所形成的一门新学科，通过综合运用多学科技术来获取丰富的生物数据。生物信息学方法可用于确定每个特定癌症患者的关键驱动因素，也可应用于研发感染性疾病的转化药物［6］。因此，探讨TXNIP蛋白的结构和功能显得尤为重要。本研究采用生物信息学方法预测分析TXNIP的基本理化性质、结构功能、空间结构、蛋白修饰及蛋白间相互作用，以期为进一步探索TXNIP在各种疾病中的作用机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1资料 TXNIP氨基酸序列的相关信息从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）中下载获取。

1.2TX NI P理化性质的预测分析 应用ExPASy系统中的ProtParam软件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析TXNIP的基本理化性质；应用在线软件ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析TXNIP的亲疏水性［7］。

1.3TX NI P信号肽的预测分析 应用SignalP 4.0 Server软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）分析TXNIP信号肽的结构［8］。

1.4TX NI P非经典型分泌蛋白的预测分析 应用专业预测非经典分泌蛋白的软件SecretomeP 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）对TXNIP的氨基酸序列进行预测评价［9］，以NN-score为主要参考值，哺乳动物序列阈值为0.600，若NNscore＞0.600，为非经典型分泌蛋白；若≤0.600，为经典型分泌蛋白。

1.5TX NI P跨膜结构的预测分析 应用生物信息学在线软件TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对TXNIP的跨膜结构进行预测分析［10］。

1.6TX NI P亚细胞定位的预测分析 应用在线软件PSORTⅡ的the k-NN Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）对TXNIP亚细胞分布进行定位分析［11］。

1.7TX NI P空间结构的预测分析 应用DNAstar软件中的Gamien-Robson和Chou-Famsman两种方法预测TXNIP的二级结构，并通过在线软件SWISSMODEL预测其三级结构［12］。

1.8TX NI P翻译后修饰位点的预测分析 应用在线软件NetNGlyc1.0Sever（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和Net-OGlyc 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）分析TXNIP的O-糖基化位点和N-糖基化位点［13］；并通过在线软件YinOYang 1.2Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）再次预测TXNIP的O-糖基化位点［14］。经在线软件Netphos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/）分析TXNIP的磷酸化位点［15］。

1.9TX NI P互作蛋白的预测分析 应用在线软件STRING（https：//string-db.org/）预测TXNIP互作蛋白，设置髙置信度为0.7，预测蛋白个数少于20个，自动生成TXNIP互作网络［16］。利用在线软件DAVID对TXNIP互作网络中所涉及的互作蛋白进行GO和KEGG分析。

1.10TX NI P在人类各组织及细胞中表达量的预测分析 应用在线生物信息学软件GTEx（http：//gtexportal.org/）对TXNIP在人类不同组织和细胞中的表达量进行预测分析［17］。

2 结果

2.1TX NI P理化性质的预测分析 TXNIP分子量为43 661.37，蛋白分子式为C1938H3085N517O579S24，理论等电点（pI）=7.46，为中性蛋白。TXNIP由20种氨基酸组成，其中缬氨酸（Val）的含量最高，占总氨基酸的10.0%；色氨酸（Trp）和组氨酸（His）最少，均仅占1.0%。见图1。有47个残基带负电荷，48个残基带正电荷；不稳定指数为37.90，表明该蛋白属于稳定性蛋白；其亲水性平均总值为-0.232，脂肪指数为83.15。TXNIP氨基酸序列中第292位疏水性最大（分值为2.633），第138位亲水性最大（分值为-2.756），表明TXNIP为亲水性蛋白，见图2。

图1 TXNIP的氨基酸组成Fig.1 Amino acid composition of TXNIP

图2 TXNIP的亲疏水性分析Fig.2 Analysisof hydrophilicity and hydrophobicity of TXNIP

2.2TX NI P的信号肽预测分析 信号肽可能的剪切位点（C）最大值为0.268，综合剪切位点与信号肽序列（Y）最大值为0.166，信号肽的序列区域（S）平均值为0.104，表明TXNIP为非分泌蛋白，且不存在信号肽序列，见图3。

图3 TXNIP的信号肽分析Fig.3 Analysis of signal peptide of TXNIP

2.3TX NI P非经典型分泌蛋白的预测分析 TXNIP的NN-score为0.731 172，高于哺乳动物阈值，因此判断TXNIP为非经典型分泌蛋白。

2.4TX NI P跨膜结构的预测分析 TXNIP的氨基酸序列全部位于膜外区，不存在跨膜区，见图4。

图4 TXNIP跨膜结构分析Fig.4 Analysis of transmembrane domain of TXNIP

2.5TX NI P亚细胞定位的预测分析 TXNIP定位于液泡、线粒体、细胞核、细胞质的概率分别为4.3%、17.4%、26.1%和52.2%。

2.6TX NI P空间结构的预测分析 Gamien-Robson和Chou-Famsman两种方法预测TXNIP中的α螺旋占比分别为26.9%和15.1%，β折叠占比分别为47.1%和38.6%，β转角占比分别为14.8%和33.8%，无规则卷曲占比均为11.5%，见图5。预测TXNIP三级结构得到拟合率最高的模型，该模型的GMQE为0.71，QMEAN为-0.32，拟合率为60%，见图6，表明此模型结构合理。

图5 TXNIP蛋白的二级结构Fig.5 Secondary structure of TXNIP

图6 TXNIP的三维结构Fig.6 Three-dimensional structure of TXNIP

2.7TX NI P翻译后修饰位点的预测分析 NetNGlyc 1.0 Sever和NetOGlyc 4.0 Server软件预测TXNIP共有14个O-糖基化位点，分别是第304、306、307、308、311、313、314、315、318、346、348、349、358和377位氨基酸，无N-糖基化位点；YinOYang 1.2 Server软件预测TXNIP共有13个位点O-糖基化，分别为第60、161、179、227、235、281、303、304、307、308、314、377和379位氨基酸。两次预测共有的O-糖基化位点包括第304、307、308、314和377位氨基酸。Netphos 2.0 Server软件预测TXNIP可能含有21个丝氨酸、6个苏氨酸和7个酪氨酸磷酸化位点。

2.8TX NI P互作蛋白的预测分析 与TXNIP互作蛋白有10个，分别为DDIT4（score：0.780）、IL2R8（score：0.847）、ITCH（score：0.972）、MLXIP（score：0.855）、MLXIPL（score：0.824）、NLRP3（score：0.988）、PTPN11（score：0.975）、TXN（score：0.999）、TXN2（score：0.947）和VAV2（score：0.911），见图7。GO分析结果显示，蛋白互作基因主要参与氧化还原酶活性、蛋白质二硫键氧化还原酶活性、磷酸酪氨酸残基结合等分子功能，见表1。涉及到调节细胞死亡、细胞通讯、甘油醚代谢过程、ATP生物合成过程的调控、对药物反应的负调控等生物学过程，见表2。KEGG分析结果显示，互作蛋白基因主要涉及NOD样受体信号通路、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病等信号通路，见表3。

表1 GO分子功能分类结果Tab.1 GOmolecular function classification

表2 GO生物学过程分类结果Tab.2 GO biological process classification

表3 KEGG路径列表Tab.3 KEGG pathway list

图7 TXNIP的互作网络Fig.7 Interaction network of TXNIP

2.9TX NI P在人类各组织及细胞中表达量的预测分析TXNIP在皮下脂肪的表达量最高；其次在生殖系统和消化系统中表达量相对较高，其中生殖系统的表达主要在女性子宫颈内膜、阴道、子宫、输卵管等部位，消化系统主要表达在胃食管交界部贲门和乙状结肠，无性别差异；TXNIP在神经系统表达量较低，表达分布在大脑伏核区基底神经节、前扣带皮层、大脑杏仁核部位，女性比男性略高；TXNIP在培养的成纤维细胞中表达量最低。见图8。

图8 TXNIP在人类不同组织和细胞中的表达Fig.8 Expression of TXNIPgene in various tissues and cells

3 讨论

小鼠TXNIP分子量约46 000［1］，包含391个氨基酸，编码于1q21-q24染色体上［18］。本研究结果表明，人TXNIP分子量为43 661.37，与小鼠TXNIP的蛋白分子量区别可能是由于种属不同所致。TXNIP是一种稳定的亲水性蛋白，不存在信号序列肽，是非经典型分泌蛋白，且TXNIP无跨膜结构域，β折叠是其二级结构的主要形式。本研究结果还显示，TXNIP属于胞内蛋白，分布于细胞质（52.2%）、细胞核（26.1%）、线粒体（17.4%）、和液泡（4.3%）。上述结论为TXNIP性质的研究提供了新的实验依据。

蛋白质翻译后修饰（post-translational modification，PTM）参与多种细胞活性，磷酸化是研究最为广泛的PTM之一，在健康状态下调节细胞生长、分化、凋亡和细胞信号转导等多种细胞功能；而磷酸化途径的改变会导致严重的疾病，尤其是癌症［19］。本研究利用多种生物信息学在线软件对TXNIP的蛋白翻译后磷酸化位点修饰进行预测分析。结果表明，TXNIP含有21个丝氨酸、6个苏氨酸和7个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点。有研究显示，大多数重组蛋白生物制剂及其生物类似物（如单克隆抗体、融合蛋白等）通常均具有糖基化［20］；TXNIP在人和啮齿动物的胰腺β细胞中均被O-GlcNAcylation修饰，且这种修饰增强了其与结合伴侣NLRP3的相互作用，进而导致炎性体的激活［21］。本研究结果显示，TXNIP不存在N-糖基化位点，采用两种方法共预测到5个共有的O-糖基化位点，分别为第304、307、308、314和377位。这些预测结果将为TXNIP在生理活动中作用机制的研究和生物制药的研发等提供参考。

膜受体、离子通道和转运蛋白、酶和激酶、信号转导和伴侣、细胞黏附和结构蛋白的本质均是蛋白质［22］。大多数生理和病理过程均体现在蛋白质水平上［23］，蛋白质间的相互作用贯穿了整个生命活动。因此，了解蛋白间的相互作用显得尤为重要。本研究对TXNIP互作网络进行了预测，结果显示，与TXNIP互作网络中密切相关的蛋白有10个，包括DDIT4、IL2R8、ITCH、MLXIP、MLXIPL、NLRP3、PTPN11、TXN、TXN2和VAV2。NLRP3炎症小体和白介素家族中IL-2R8的存在证明炎症与TXNIP蛋白有关；另有文献表明，ITCH可能与潜在的恶性肿瘤有关，最常见的是白血病和淋巴瘤［24］；MLXIPL是一个在肝脏糖酵解和脂肪形成调控过程中发挥重要作用的转录因子，在能量存储方面具有关键作用［25］；DDIT4通过P53和MAPK途径促进胃癌的增殖和肿瘤的发生［26］；另外，有证据表明TXN可通过抑制STAT3/NF-κB和Bcl-2信号通路增强5-氟尿嘧啶（5-Fu）的作用，辅助治疗人胃癌［27］。本研究表明，在蛋白互作网络中，TXNIP与这些蛋白的关系最为密切，提示TXNIP在癌症和代谢等疾病中发挥一定作用，有可能成为治疗的新靶点。

根据TXNIP互作蛋白的KEGG结果显示，互作基因显著富集于NOD样受体信号通路。NOD样受体的代表分子NLRP3炎症小体，可刺激caspase-1的起始进而响应细胞危险信号释放出IL-1β和IL-18，从而诱导细胞凋亡［28］。炎症小体已成为宿主免疫力的重要天然传感器，当细胞遇到氧化应激时，定位在细胞核中的TXNIP会转移至线粒体中，与其中的TRX2结合，使凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）释放，激活由ASK1介导的细胞凋亡途径［29］。另外，TXNIP互作基因显著富集在胰岛素抵抗通路中，MLXIP、MLXIPL是胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝病信号通路中共同的关键信号分子，PIPN11、VAV2是动脉粥样硬化和白细胞跨内皮迁移两个信号通路中共同的信号分子。因此，TXNIP与MLXIP、MLXIPL、PIPN11和VAV2之间的互作关系值得进一步深入研究。有研究表明，当细胞内葡萄糖浓度较高时，TXNIP会转移至细胞膜，促进了葡萄糖转运体1（glucose transporter 1，GLUT1）的内吞作用，使细胞膜上GLUT1减少，同时降低了GLUT1的表达量，减少葡萄糖的吸收［30］，TXNIP已成为调节胰岛β细胞功能紊乱和凋亡的主要因素［31］。TXNIP的表达与多种疾病如中枢神经系统疾病、糖尿病、癌症等疾病的发生发展密切相关［32］，探讨TXNIP在各通路中的作用也有助于深化了解TXNIP在各疾病中的发病机制。

基因型-组织表达数据库可提供人类组织及细胞中各基因的表达情况，经该数据库分析发现，TXNIP在皮下脂肪组织表达最多［33］。据报道，TXNIP在2型糖尿病中发挥着一定作用，在分离的胰岛β细胞中，葡萄糖通过TXNIP启动子中的碳水化合物反应元件刺激TXNIP转录，导致TXNIPmRNA表达增加［31，34-35］。近年研究显示，皮下脂肪组织内皮细胞中血管生成素2-整合素α5β1信号通路在调节全身脂肪分布，促进代谢健康方面发挥着重要作用，其机制是血管生成素2激活内皮细胞中的整合素α5β1信号，并触发脂肪酸通过CD36和FATP3转运至皮下脂肪组织中，该结果证明了脂肪细胞-内皮细胞的相互干扰是预防异位脂质沉积诱导的脂毒性和胰岛素抵抗的潜在靶点［36］，但皮下脂肪组织中的TXNIP在糖尿病过程中的作用及其作用机制均有待进一步研究。本研究为进一步探索TXNIP在机体生命活动中的作用机制提供了实验依据。