恩诺沙星和环丙沙星在肉鸡体内残留与代谢研究进展

陈苏蒙，薛 毅，赵程祥，贾 曼，张宏达，陈 刚*

(1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125；3.天津理工大学化学化工学院，天津 300384)

喹诺酮类药物是动物使用最广泛的抗生素之一，它们在动物中的主要用途是治疗细菌感染、预防感染和作为食用动物的生长促进剂[1-2]。我国大部分肉鸡养殖环境较差，不法商贩为降低肉鸡的病死率，存在使用禁用兽药与抗生素等行为，同时由于政府监管不到位，导致我国肉鸡养殖尚存在较大的食品安全隐患[3]。在动物养殖中滥用抗生素，以及在动物接受抗生素治疗后，或者在药物代谢排泄之前屠宰药物动物，可能导致这些抗生素及其代谢物残留在供人类食用的食品中。摄入这种食物可能会导致健康风险，如过敏问题、毒性问题，以及抗生素残余物通过食物链传递给人类时，导致耐药菌株的数量增加而产生的耐药问题[4]。为了规范这些药物的使用，制定了动物食品中的这些抗生素最大残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)的一系列政策和措施，包括根据每个物种和组织中的MRL，以此来避免对消费者健康造成风险。然而目前制定的MRL只限制于活性化合物(抗生素)或主要的已知代谢物，而其他未知代谢物和转化物可能通过与生物物质相互作用或自身代谢形成，不包括在食品中的恩诺沙星和环丙沙星最大残留限量(GB31650-2019)法规中。因此，有必要对这些未知代谢物和转化物进行研究，以了解可能对人类健康产生的相关毒性或有害影响，并避免产生误导性结果[5-6]。本文综述恩诺沙星与环丙沙星两种常用的喹诺酮类药物在肉鸡体内残留与代谢物检测方面(研究方法主要包括：高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、胶体金标记单克隆抗体及竞争抑制方法)的研究进展，并探究恩诺沙星、环丙沙星在不同品类鸡中代谢分布与残留消除规律的异同，为进一步研究喹诺酮类药物在不同品种肉鸡中的残留与代谢物检测提供参考。

1 恩诺沙星和环丙沙星在肉鸡方面的残留检测研究

1.1 高效液相色谱(HPLC)法 高效液相色谱具有溶质扩散速度快、在较短的时间内获得目标数据的优点。高雪梅等[7]选取40日龄，体重为1.5±0.2 kg的黄羽肉鸡进行100 mg/L恩诺沙星饮水给药，混饮7 d后，取肌肉、全肝、全肾，经处理检测后，结果表明：在肌肉及肝脏停药后7 d、肾脏停药后3 d的组织中，恩诺沙星残留量均低于规定MRL。并且表明在零休药期时，肝脏中的残留量大于肌肉大于肾脏，药物在肝脏中消除最为缓慢。Garcia-Ovando H等[8]开发了一种提取和液相色谱测定鸡肌肉中恩诺沙星残留的技术。肌肉样品用二氯甲烷和离心三步提取以从肌肉中分离恩诺沙星，检测限(LOD)为0.00048 μg/mL，定量限(LOQ)为0.0039 μg/mL，回收率平均为86.67%。郑育基[9]建立的HPLC可同时检测鸡血浆中恩诺沙星和环丙沙星的残留量，此方法的LOD与LOQ分别为0.01 μg/mL与0.05 μg/mL，回收率在87.26%～106.36%。

Aslam B 等[10]采用HPLC检测肉(n=75)和肝脏(n=75)样品中恩诺沙星残留，肉类和肝脏样品中恩诺沙星的总体平均残留浓度分别为208±55 μg/kg和527±84 μg/kg。该研究表明，52%的肉类和78.7%的肝脏样本对恩诺沙星呈阳性，58.3%肉和71.2%肝脏样品残留浓度高于MRL，使用这种受污染的肉类可能会引起消费者的抵抗，并且对公共健康构成威胁。Verma M K等[11]收集了来自家禽养殖场和零售市场的鸡肉样品(包括肌肉、肝脏、肾脏和脂肪)。分析结果显示，43.58%的肉类样本对恩诺沙星呈阳性，38.71%肉类样本对环丙沙星呈阳性。其中，45.17%的样品浓度高于恩诺沙星的MRL，50.28%的样品浓度高于环丙沙星MRL。因此,可以得出结论，在鸡肉中使用这些抗菌剂对肉类可能会造成污染，导致消费者产生耐药性，对公共健康构成威胁[12]。

1.2 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法 为了获得更加精准的数据，研究者们将液相色谱与质谱法串联共同检测物质的含量[13]。Arslan-Acaroz D等[14]通过LC-MS/MS方法研究鸡肝脏样品，方法检测限为1.17 mg/kg(恩诺沙星)和1.24 mg/kg(环丙沙星)。分别在39%和31%的样品中检测到恩诺沙星和环丙沙星，结果发现所有鸡肉中两种抗生素残留水平的总和远低于规定的最大残留水平。Zamoum R等[15]采用LC-MS/MS法检测和鉴定鸡肉中磺胺类和喹诺酮类的残留，151只鸡样品来自阿尔及利亚中部地区17个城市的30个屠宰场。结果表明，至少43%的样品中存在抗生素，喹诺酮类药物的筛查显示样品的污染百分比为26.5%，其中恩诺沙星占19.86%。

潘丽花[16]建立的HPLC-MS/MS方法则可在鸡可食性组织中同时测定27种喹诺酮类药物(含恩诺沙星与环丙沙星)的含量。Martin B S等[17]选取白来航白羽肉仔鸡，进行了10 mg/kg的恩诺沙星肌肉注射，经HPLC-MS/MS检测，药物残留量均低于欧盟和日本MRL。孙红洋等[18]建立的HPLC-MS/MS方法可检测恩诺沙星与环丙沙星在鸡蛋及鸡可食性组织中的残留量。此方法的LOD与LOQ分别为1 μg/kg与5 μg/kg，两种药物的平均回收率范围在75.5%～106%之间。

1.3 胶体金标记单克隆抗体及竞争抑制法 胶体金技术具有特异敏感性，且其稳定性强，竞争性抑制可阻碍底物与酶的结合，从而判断出酶的活性部位等。孙晓峥[19]等采用了胶体金标记单克隆抗体及竞争抑制法检测肉鸡中喹诺酮类药物，并组装了检测氟喹诺酮类(恩诺沙星、环丙沙星等10种)抗生素残留的胶体金免疫层析试纸条，以供目标药物的快速检测。王宵雪等[20]建立了胶体金免疫层析分析方法，15种喹诺酮类药物及8种常用兽药对恩诺沙星免疫胶体金快速检测均无明显干扰，表明胶体金检测氟喹诺酮类抗生素残留具有良好的特异性、灵敏度、稳定性，且操作简单、检测快速，适合现场检测。Ha M S等[21]通过荧光染料标记的微粒与恩诺沙星分子共价结合，溶液中的恩诺沙星与微粒固定的恩诺沙星(enroMPs)竞争结合芯片上的抗体，结合恩诺沙星的微粒会出现荧光来检测恩诺沙星。在最佳条件下，恩诺沙星实现了高动态范围浓度范围为1～1000 μg/kg，标准溶液的检测限和定量限分别为5 μg/kg和20 μg/kg，明显低于最大残留限量。使用简单的提取方法，强化牛肉、猪肉和鸡肉样品的回收率为43.4%～62.3%。由于其灵敏度、特异性、简单性和快速性，将有助于以高通量方式检测和近似定量食品中的恩诺沙星残留。

1.4 其他检测方法 Panzenhagen P H N等[22]研究调查了恩诺沙星ELISA 检测试剂盒与 LC-MS/MS 相比检测肉鸡组织中恩诺沙星残留的效率。从6个不同的屠宰场获得 72 个样品的肉鸡组织。ELISA和HPLC被用来鉴定和量化样品对恩诺沙星的污染。总共72%的分析样品含有恩诺沙星ELISA检测到的残留物和22.2%的残留物被LC-MS/MS检测到。所有通过LC-MS/MS检测到的恩诺沙星残留阳性样品通过ELISA也呈阳性。这些数据证实了ELISA测试的效率，并建议将其用作家禽组织中恩诺沙星残留的筛选方法，因为它结果快、价格低且适用性强。

Barrón D等[23]提出了一种以马波沙星为内标分析鸡肌肉中恩诺沙星和环丙沙星的方法。样品的净化和预浓缩通过固相萃取进行，并使用光电二极管阵列检测器通过毛细管电泳进行测定，恩诺沙星和环丙沙星的校准曲线在10～300 μg/kg范围内呈线性，恩诺沙星和环丙沙星的方法回收率分别为74%和54%，这两种化合物的检测限低于25 μg/kg，这允许在所需的最大残留限下检测阳性肌肉样品。Rasheed C M等[24]开发了一种新颖、简单、快速、应用广泛且可靠的衍生分光光度法，用于测定恩诺沙星。一阶导数分光光度法测定恩诺沙星的浓度范围为0.3～31.0 μg/kg，回收率在93.01%～103.67%的范围内，该方法用于测定不同鸡肌肉、肝脏和肾脏样品中的这些抗生素。

2 恩诺沙星和环丙沙星在代谢转化方面的研究

陈杖榴等[25]发现在家禽使用恩诺沙星后，药物在体内广泛分布，主要通过肾脏可排泄15%～50%的原形药物；肝脏为次要代谢消除的途径，主要代谢物为环丙沙星，次要代谢产物为恩诺沙星氧化物与葡萄糖醛酸结合物；环丙沙星在1.8～2.0 kg肉鸡体内的主要代谢产物为去乙烯环丙沙星与氧基环丙沙星。Slana M等[26]利用HPLC法研究了肉鸡连续5 d口服恩诺沙星对其代谢和排泄的影响，并证实了恩诺沙星及其代谢物环丙沙星、去乙烯恩诺沙星(DES-EF)和去乙烯环丙沙星(DES-CF)的存在。恩诺沙星饮水给药后1～13 d，恩诺沙星在第1天至第13天期间主要以母体化合物的形式排出。在第1天至第6天的排泄物中检测到环丙沙星，而少量的去DES-EF与去DES-CF仅分别在第1天至第7天和第1天至第6天排泄。Morales-Gutierrez F J等[27]使用LC-MS技术鉴定了鸡肌肉中恩诺沙星与环丙沙星的新代谢物与转化产物(TPs)。结果检测出了21种恩诺沙星TPs，6种环丙沙星TPs，以及14种代谢产物。并表明去乙烯-喹诺酮是最显著的TPs，以及含量较低的其他代谢产物，如哌嗪环裂解、芳香环去氟以及芳香环去氟双羟基化后的产物。

图1 恩诺沙星主要代谢产物

图2 环丙沙星主要代谢产物

柳爱春等[28]的研究发现恩诺沙星在麻鸡黄羽肉鸡体内转化率高，代谢慢，环丙沙星在麻鸡黄羽肉鸡体内转化率较低，其中肝脏中主要TPs与恩诺沙星的代谢产物相似，为培氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星及氧氟沙星。而应翔宇等[29]在白羽艾维茵肉鸡体内注射恩诺沙星后的代谢产物中未检测出环丙沙星。对于恩诺沙星在鸡中的主要代谢产物研究结果不同，推测可能是由于实验鸡的不同品种或品类导致药物在鸡体内的代谢消除速率不同，从而在不同检测时间点检测出的代谢物含量有较大差异，致使出现在检测时无目标代谢物的现象。

Turnipseed S B等[30]建立了四极飞行时间(Q-TOF)液相色谱-质谱(LC-MS)分析兽药残留转化的方法，发现恩诺沙星的主要残留是环丙沙星，另一种与恩诺沙星不同的氟喹诺酮类药物，通过在线数据库搜索具有相同分子量的氟喹诺酮化合物，最终证明为培氟沙星损失-CO2和-C4H7NO2的相对应的低质量产物离子。ANADO'N A等[31]给健康鸡单次静脉注射和口服环丙沙星(8 mg/kg)，测定环丙沙星及其代谢物的药代动力学特性。静脉注射和口服给药后，血浆浓度-时间曲线具有二室开放模型的特征。环丙沙星主要转化为氧环丙沙星和去乙烯环丙沙星。当口服环丙沙星(连续3 d 8 mg/kg)时，发现相当多的肾脏、肝脏、肌肉和皮肤脂肪组织中含有环丙沙星及其代谢物恶环丙沙星和去亚乙基环丙沙星。Haag G等[32]为了研究肉鸡羽毛中恩诺沙星/环丙沙星残留的药代动力学，建立高效液相色谱-荧光法定量测定肉鸡羽毛中残留的恩诺沙星和环丙沙星，计算这些药物在人类食用前的等待时间，研究结果表明在9 d内在羽毛中检测到这两种化合物。这种分析方法表现出良好的线性，选择性，准确度和精密度，该研究在研究羽毛中恩诺沙星/环丙沙星残留方面具有重要应用。

3 展 望

经上述研究总结目前制定的恩诺沙星和环丙沙星的MRL只限制于原药形式或主要的已知代谢物的检测，恩诺沙星主要代谢物为环丙沙星、去乙烯环丙沙星、培氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星及氧氟沙星；环丙沙星主要代谢物为培氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星和去乙烯环丙沙星，而其他未知代谢物和转化物研究较少，因此，有必要对这些未知代谢物和转化物建立相关的研究方法，以完善其相对应的法律法规。其次发现在2020版《中国兽药典》与GB31650-2019中都未提及环丙沙星的用法用量，建议进行相关实验研究并完善相应的资料内容。最后，发现抗菌药物在乌骨鸡体内的残留消除时间远远高于其他品类鸡，推测主要原因是由于氟喹诺酮类药物通过碱性氮原子与乌骨鸡体内的黑色素结合，导致氟喹诺酮类药物在乌鸡皮脂及肌肉内残留浓度较高，对于此现象，将来可进行乌骨鸡黑色素基因方面的相关实验研究进一步分析其代谢消除较慢的具体原因。