MSCT灌注参数与结直肠癌GRHL3、SEMA6B表达水平的相关性研究

王华， 容练， 陶俞安

结直肠癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤，位列中国癌症死亡原因第5位，近年来结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势[1]。结直肠癌的发生、发展机制非常复杂，目前还未完全明确。近年来，随着分子生物学的发展，许多学者密切关注与结直肠癌病理特征及预后有关的分子标志物[2,3]。果蝇头状因子3(Grainyhead-like 3，GRHL3)是转录因子家族的成员之一，最近的研究显示，GRHL3表达水平上调时可促进结直肠癌的生长和转移，并且与患者的不良预后有关[4,5]。信号素6b(Semaphorin 6b，SEMA6B)是轴导信号家族中的一个成员分子，已被证实在多种癌症中表达异常，相关研究显示SEMA6B在结直肠癌组织中的表达显著上调，并且SEMA6B高表达与结直肠癌患者不良预后和肿瘤免疫抑制微环境相关[6]。因此，GRHL3和SEMA6B均是结直肠癌患者的有效预后标志物。然而，目前对这些分子标志物的检测都是有创性的，诊断需通过活体组织标本结合病理结果才能得到。MSCT灌注成像技术可以清晰显示癌灶内的血管和血液流动状态，已被证实在结直肠癌的诊断及临床病理分期中具有重要价值[7,8]。然而，目前还未有研究探讨结直肠癌MSCT灌注参数与GRHL3、SEMA6B这些预后分子标志物的相关性。因此，本研究旨在通过比较不同GRHL3、SEMA6B表达水平结直肠癌患者的MSCT灌注参数，以期术前无创性对结直肠癌预后进行评估，从而为选择疾病的最佳治疗策略提供影像学依据。

材料与方法

1.病例资料

前瞻性选择2019年9月-2021年9月于本院就诊并行手术治疗的74例结直肠癌患者作为研究对象，其中男41例，女33例，平均年龄(61.04±4.26)岁，结肠癌28例，直肠癌46例。术中取癌组织和远离癌组织的正常结直肠黏膜组织。病例纳入标准：①年龄18～70周岁；②经病理确诊为结直肠腺癌；③未进行过抗肿瘤治疗；④影像学和临床、病理资料完整。病例排除标准：①合并其他部位肿瘤；②患有严重心、脑、肝、肾疾病；③合并其他消化道疾病，如急慢性胃肠炎、十二指肠溃疡、炎症性肠病等；④存在严重的水电解质及酸碱平衡紊乱。所有患者及其家属均对本研究知情同意，并签署了知情同意书。本研究得到了医院伦理委员会的批准。

2.研究方法

MSCT检查及图像分析：受检者检查前禁食6 h，使肠道清空；检查前10～15 min肌注盐酸消旋山崀菪碱10 mg；经Foley's导尿管将温生理盐水从肛门注入患者肠管，直至患者略感不适。受检者取仰卧位，采用64层CT扫描机对患者腹盆部进行CT平扫，选择癌灶最大层面进行灌注，以6 mL/s流率将50 mL碘普罗胺注射液经患者肘前静脉注入，延迟10 s后进行灌注扫描，持续时间60 s，管电压为100 kV，管电流为100 mA。将扫描图像上传至工作站，由两位经验丰富的影像医师应用程序处理软件分析扫描图像，若出现意见分歧，经商讨后达成一致。选择感兴趣区进行定量分析，注意避开血管及肿瘤边缘区、肿瘤坏死区；由工作站中的软件计算灌注参数，包括血容量(blood volume，BV)、血流量(blood flow，BF)、达峰时间(time to peak，TTP)和表面通透性(permeability surface，PS)，记录两位医师得到的参数平均值。

免疫组化检查及判定标准:术中取患者肿瘤组织和癌旁正常组织，组织离体后立即置入-196℃液氮中保存待用。采用免疫组织化学法检测组织中的微血管密度(microvessel density，MVD)值及GRHL3、SEMA6B表达水平。采用双盲法对检测结果进行评估，若出现分歧，则与第3位病理科医师商讨后确定最终结果。MVD值判定：以被CD34染色成孤立的棕黄色内皮细胞或内皮细胞团认为1个微血管，先以低倍镜选择微血管数量最多区域后，转换至高倍镜下，随机挑选10 个视野，所得均值即为MVD值。GRHL3、SEMA6B表达水平判定：①显色强度计分：无着色计为0分，浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分；②阳性细胞百分比计分：≤5%计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，>75%计为4分，取显色强度计分与阳性细胞百分比计分的乘积作为最终得分，分数>3分认为阳性表达，≤3分认为阴性表达。

3.统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验；分类资料以频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。两符合正态分布的定量变量间的相关性采用Pearson相关性分析。采用受试者工作特征 (receiver operating characteristic,ROC)曲线分析MSCT灌注参数对分子标志物表达水平的预测效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.结直肠癌组织与癌旁正常组织GRHL3、SEMA6B表达水平的比较

结直肠癌组织中的GRHL3阳性表达者比例(70.27%)显著高于癌旁正常组织(33.78%)，差异有统计学意义(P<0.001)；结直肠癌组织中的SEMA6B阳性表达者比例(63.51%)高于癌旁正常组织(31.08%)，差异有统计学意义(P<0.001，表1)。

表1 两种组织的GRHL3、SEMA6B表达水平比较 (例)

2.不同GRHL3和SEMA6B表达水平结直肠癌患者的临床病理特征比较

不同GRHL3表达水平结直肠癌患者的肿瘤大小及TNM分期比较差异有统计学意义(P<0.05)，而性别、年龄、分化程度比较差异均无统计学意义(P值均>0.05，表2)。不同SEMA6B表达水平结直肠癌患者的分化程度及TNM分期比较差异有统计学意义(P<0.05)，而性别、年龄、肿瘤大小比较差异均无统计学意义(P值均>0.05，表3)。

表2 不同GRHL3表达水平结直肠癌患者的临床病理特征比较 (例)

表3 不同SEMA6B表达水平结直肠癌患者的临床病理特征比较 (例)

3.不同GRHL3表达水平结直肠癌患者的MSCT灌注参数比较

GRHL3阳性与阴性表达结直肠癌患者(图1、2)的BV比较差异无统计学意义(P>0.05)；GRHL3阳性表达结直肠癌患者的BF显著低于阴性表达者，TTP和PS显著高于阴性表达者，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表4)。

图1 患者，男，63岁，GRHL3阳性表达，SEMA6B阳性表达。a)BF伪彩图，参数值为19.2mL/100g；b)BV伪彩图，参数值为40.4mL/min·100g； c) TTP伪彩图，参数值为20.5s； d) PS伪彩图，参数值为32.8mL/min·100g。

图2 患者，女，55岁，GRHL3阴性表达，SEMA6B阴性表达。a)BF伪彩图，参数值为20.5mL/100g；b)BV伪彩图，参数值为41.6mL/min·100g；c)TTP伪彩图，参数值为18.4s；d)PS伪彩图，参数值为30.5mL/min·100g。

表4 不同GRHL3表达水平结肠癌患者的MSCT灌注参数比较

3.不同SEMA6B表达水平结直肠癌患者的MSCT灌注参数比较

SEMA6B阳性与阴性表达结直肠癌患者的BV和PS比较差异无统计学意义(P>0.05)；SEMA6B阳性表达结直肠癌患者的BF显著低于阴性表达者，TTP显著高于阴性表达者，差异有统计学意义(P值均<0.05，表5)。

表5 不同SEMA6B表达水平结肠癌患者的MSCT灌注参数比较

4.MSCT灌注参数与结直肠癌MVD的相关性

MSCT灌注参数BV、BF、TTP、PS与MVD间均无显著相关性(r值分别为0.115、0.108、-0.055和-0.081，P值分别为0.329、0.360、0.640和0.495，图3)。

图3 MSCT灌注参数与结直肠癌MVD的相关性散点图。a)BV与MVD的相关性散点图；b)BF与MVD的相关性散点图；c)TTP与MVD的相关性散点图；d)PS与MVD的相关性散点图。

5.MSCT灌注参数与结直肠癌GRHL3、SEMA6B表达水平的二元Logistic回归分析

以MSCT各灌注参数的中位值(BV：19.21 mL/100g；BF：40.42 mL/ min·100g；TTP：18.16 s；PS：

30.48 mL/min·100g)为截断值，将其分为低水平和高水平，并进行赋值(低水平=0，高水平=1)。以GRHL3、SEMA6B表达水平(阴性表达=0，阳性表达=1)为因变量，将MSCT各灌注参数水平及临床病理特征单因素分析有意义的变量纳为自变量，进行多因素Logistic分析。结果显示，高水平TTP是GRHL3阳性表达的独立预测因子，高水平TTP及TNM分期III期是SEMA6B阳性表达的独立预测因子(P值均<0.05，表6)。

表6 MSCT灌注参数与GRHL3、SEMA6B表达水平的二元Logistic回归分析

讨 论

结直肠癌是临床上常见的一种胃肠道肿瘤，患者早期多无明显的临床症状，但随着病情的进展，可能会出现便秘、腹泻、腹痛及排血便等症状，晚期结肠癌患者会出现体重下降及严重贫血等，严重影响患者的生命健康和生活质量[9]。结直肠癌的发生、发展机制目前尚未明确，近年来随着分子生物学的迅猛发展，许多研究者开始关注结直肠癌相关病理和预后分子标志物的研究，以期找到结直肠癌分子靶向治疗的突破点[10]。GRHL3和SEMA6B已被证实在结直肠癌的发生、发展中发挥着至关重要的作用。本研究结果显示，GRHL3和SEMA6B在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，这与之前的研究结果相似[4,6]。Tan等[4]的研究结果显示，GRHL3在结直肠癌组织中表达显著上调，并且GRHL3表达水平与结直肠癌的临床病理特征相关，GRHL3高表达与肿瘤大小、TNM分期、浸润程度、淋巴结转移密切相关，提示GRHL3的高表达可能与结直肠癌恶性程度有潜在的相关性，此外，多因素Cox回归分析结果显示，GRHL3阳性是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。本研究结果也显示，肿瘤大小及TNM分期与GRHL3表达水平有关，阳性表达患者的肿瘤直径较大，且TNM分期较晚。Li等[6]的研究结果表明，SEMA6B在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且多因素Cox回归分析结果显示SEMA6B是结直肠癌患者无进展生存的独立预后影响因素，SEMA6B高表达与低生存率密切相关，本研究结果提示，肿瘤分化程度及TNM分期与SEMA6B表达水平有关，阳性表达患者的肿瘤分化水平较高，且TNM分期较晚。因此，GRHL3和SEMA6B都是结直肠癌患者相关的预后分子标志物，术前通过影像学检查无创性预测其在结直肠癌中的表达水平对疾病的临床诊治可提供一定参考价值。

MSCT灌注成像是通过增强CT扫描获得动态CT图像，测量对比剂在目标检测组织的密度和时间变化，从而反映组织灌注状态的一种影像学技术[11,12]。本研究结果显示，MSCT灌注参数中的BF、TTP、PS与GRHL3的表达水平有关，BF、TTP与SEMA6B的表达水平有关。BF是指对比剂进入组织中的流速，可直接反映组织灌注状态；TTP是指对比剂从开始注射时至组织强化达到峰值的时间，也是反映血流速度和组织灌注状态的指标；PS是指对比剂由毛细血管进入细胞间隙的速率，可反映肿瘤成熟度和肿瘤血管网紧密性。丰富的血液供应是恶性肿瘤细胞快速增殖的必要条件[13]，恶性肿瘤新生血管网络发达，血流速度快，病灶呈高灌注状态[14]。之前的研究显示，MSCT灌注参数与结直肠癌的临床病理分期有关[8]，分期较晚的患者，其内部可供肿瘤生存空间有限，组织内压力增大，使得毛细血管受压，减慢了血流速度，从而延长了达峰时间。此外，由于血流量不足与肿瘤高度耗氧的矛盾存在，致使肿瘤细胞的侵袭及转移能力增强。本研究通过以MSCT各灌注参数的中位数作为阶段值将其分为不同水平，进一步应用二元Logistic回归分析探讨了MSCT各灌注参数与GRHL3、SEMA6B表达水平的相关性，结果显示，较高的TTP是GRHL3和SEMA6B阳性表达的独立预测因子。这一结果也提示，TTP较高时可能预示着患者预后较差。

此外，本研究还分析了MSCT各灌注参数与MVD的相关性，结果显示BV、BF、TTP、PS与MVD间均不存在显著相关性。虽然MVD在一定程度上可反映肿瘤新生血管的生成能力，但肿瘤内血管生成存在不均一性，而应用免疫组化法检测MVD值时，包括取材部位、染色方法和计数误差等因素均会对结果判断产生影响，因此MVD值并不能全面反映肿瘤的血管生成情况[8,15]。

本研究存在以下不足之处：首先，本研究纳入的所有患者均来自同一家医院，且样本量不大，因此选择偏倚不可避免；其次，结肠癌和直肠癌在影像检查选择、治疗方式、预后等方面存在较大差异，但考虑到样本量的局限，笔者未对其进行分别分析；最后，已有研究证实GRHL3、SEMA6B是结直肠癌的预后分子标志物，但相关的预后预测研究仍处于初步阶段，并且因为灌注算法、ROI勾画及空腔型脏器ROI勾画困难等原因，CT灌注参数的重复性较低，这些因素给本研究带来了一些不确定性，在未来有条件的情况下，我们会继续对此进行研究。

综上所述，MSCT灌注参数与结直肠癌GRHL3、SEMA6B表达水平具有一定相关性，高水平TTP是GRHL3和SEMA6B阳性表达的独立预测因子。