沼泽红假单胞菌发酵提高黄芪甲苷含量的条件优化

李保珍，刘琪，王鑫，贾璐，郭羽，樊金华

（1.山西中医药大学 基础医学院，山西 晋中 030619；2.山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801）

黄芪（Astragalus）是豆科多年生草本植物的干燥根，为我国传统中药材，含有黄芪多糖类、黄芪皂苷类、黄酮类和氨基酸等多种有效成分［1］，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓和敛疮生肌等功效［2］。其中，黄芪甲苷是黄芪皂苷的主要活性成分，有明显的抑制癌细胞侵袭转移、改善心脏收缩和舒张等功能［3-4］，也是《中国药典》中黄芪质量标准检测的标志物［5］。但由于黄芪甲苷在黄芪中含量非常低，市场对黄芪的需求量在逐年增加，传统使用方法已经不能满足社会的需求［6］。

中药发酵最早记载于在我国汉代的中药专著《神农本草经》，是传统中药加工炮制的重要方法。以传统中药材为发酵原料，微生物以其自身特有的酶系使由纤维素、半纤维素等构成的中药材细胞壁发生裂解，促进其有效成分的释放，提高活性成分含量、提高药效、降低成本和扩大应用范围，已成为现代中药研究的热点［7］。陈丽艳等［8］研究报道，运用双向发酵技术，黄芪经侧耳菌（Pleuro⁃tus ostreatus）发酵后多糖含量明显增加，表明利用发酵技术可以使黄芪活性成分得到较大程度的释放。郭羽等［9］利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevi⁃siae）发酵中药黄芪，结果表明发酵对黄芪中多糖含量有一定影响，其产率与传统法相比有一定提高；郭云霞等［10］通过甲基营养型芽胞杆菌（Bacil⁃lus methylotrophic）N-14 发酵黄芪后总多糖的含量提高了57.31%。刁欢等［11］研究显示，经黑曲霉（Aspergillus niger）固态发酵黄芪，黄芪中黄酮含量提高了2.29 倍。马玉俊等［12］利用坚强芽胞杆菌-CX10（Bacillus firmus）发酵黄芪，黄芪多糖质量分数可达到69.3%。迄今为止，在众多发酵黄芪菌种报道中，沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomo⁃nas palustris）发酵黄芪的研究还未见报道。

沼泽红假单胞菌是一种紫色非硫细菌，属于变形菌门、红螺菌科、红假单胞菌属。沼泽红假单胞菌新陈代谢方式多样，可以通过自然界存在的4种代谢模式进行生长，包括光合自养、光合异养、化学自养和化学异养，已被广泛应用于农业、渔业、环保和医药等领域［13］。本文利用实验室保藏的一株沼泽红假单胞菌N 菌株发酵黄芪，探究发酵对黄芪中黄芪甲苷含量的影响，研究结果将为今后利用微生物发酵黄芪提供菌种资源以及中药黄芪高效利用提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palus⁃tris）N 菌株［14］，来自山西大学生命科学学院光合细菌研究室。

1.1.2 试剂与仪器

黄芪购自榆林市广济堂中药开发有限责任公司（产地内蒙古）；黄芪甲苷标准品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司（批号：7604）；香草醛购自索莱宝（批号：114K011）；其它试剂均为分析纯；BioTek 酶 标 仪（BioTek Instruments，Inc）；HPX-9052MBE 电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；湘立TGL16M 离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；雷磁PHS-25 型数显pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；LFP-800T 高速多功能粉碎机（莱芙）等。

1.2 试验方法

1.2.1 沼泽红假单胞菌发酵黄芪

采用RCVBN 培养基［15］进行黄芪液态发酵培养。黄芪粉碎至40 目后按照1∶10 的料液比制备液体培养基，121 ℃灭菌20 min 后在无菌条件下10%菌种接种量接菌，在温度为30 ℃，光照强度为1500 lux 条件下发酵培养。

1.2.2 黄芪甲苷的提取与测定

（1）标准曲线的制作：参照吕凤娇等［16］所述方法进行标准曲线的绘制，利用酶标仪在波长540 nm 处测定吸光度值。以黄芪甲苷溶液浓度C（μg·mL-1）为横坐标，吸光度值A为纵坐标进行线性回归，得吸光度值A 与黄芪甲苷溶液浓度C之间的线性回归方程式为Y=0.010 9X+0.000 14，相关系数为R2=0.999 6。

（2）黄芪甲苷的提取：参照侯美如等［17］所述方法，取黄芪发酵液20 mL，置于振荡器上振荡60 min，转 速为300 r·min-1，然 后 以4000 r·min-1离 心10 min，取上清液。将上清液置于分液漏斗中，加入20 mL 的正丁醇，进行萃取。NaOH（浓度1%）洗涤3次后，蒸馏水洗至中性，收集正丁醇溶液，置于70 ℃挥干，用甲醇定溶于5 mL 容量瓶中备用。

（3）黄芪甲苷含量测定：参照上述标准曲线绘制所述方法进行吸光度值测定，代入回归方程计算其含量。

1.2.3 单因素试验考察

在发酵温度30 ℃，培养基初始pH 值7.0 和菌种接种量10%的条件下，分别发酵3、4、5、6 d，考察发酵时间对黄芪甲苷含量的影响。

在发酵温度为30 ℃，菌种接种量为10%和发酵时间为5 d 的条件下，将培养基初始pH 值分别设计为6.2、6.6、7.0、7.4，考察培养基初始pH 值对黄芪甲苷含量的影响。

在发酵时间为5 d，培养基初始pH 值为7.0，菌种接种量为10%的条件下，将发酵温度分别设计为25、30、35、40 ℃，考察发酵温度对黄芪甲苷含量的影响。

在发酵温度30 ℃，培养基初始pH 值7.0 和发酵时间为5 d 的条件下，将菌种接种量分别设计为6%、8%、10%、12%，考察菌种接种量对黄芪甲苷含量的影响。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，选择发酵时间、培养基初始pH 值、发酵温度和菌种接种量4个因子，每个因子在3 水平下，以黄芪甲苷的含量为考察指标对沼泽红假单胞菌发酵对黄芪甲苷含量的影响进行正交试验并作方差分析。因素水平设计见表1。

表1 正交设计因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal design

1.2.5 数据分析方法

试验数据以Excel 2019 软件整理数据和Origin 8.5 作图，同时采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，采用one-way ANOVA 进行差异显著性分析，每组试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对黄芪甲苷含量的影响

由图1可知，发酵时间为3～5 d 时，黄芪甲苷含量随着发酵时间的延长而增加，至5 d 时达到最大值。但是发酵5 d 以后，随着发酵天数的增加，黄芪甲苷含量却显著下降。发酵时间是影响微生物发酵结果的重要因素，发酵时间短，产生相应酶量相对较少，影响黄芪甲苷释放；然而发酵时间过长，培养基所能提供的养分不足，有可能会使产酶的性能下降，影响黄芪甲苷产量［11］。同时，随着发酵时间延长，培养基中适宜于利用的碳源基本耗尽，此时沼泽红假单胞菌将含有环状结构、难降解的黄芪甲苷等作为碳源，以维持其正常的生长代谢［13］，这也是发酵后期黄芪甲苷含量降低的可能原因之一。因此，发酵时间应控制在5 d 左右。

图1 发酵时间对黄芪甲苷含量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the content of astragaloside IV

2.1.2 培养基初始pH 值对黄芪甲苷含量的影响

由图2可知，培养基初始pH 值对黄芪甲苷含量有一定的影响，随着培养基初始pH 值的升高，黄芪甲苷含量也逐渐增大，培养基初始pH 值达到7.0 时含量最大。当培养基初始pH 值再继续升高，黄芪甲苷含量小幅下降。沼泽红假单胞菌最适的生长pH为6.8～7.2，因此在发酵时培养基初始pH 值维持在中性更有利于黄芪甲苷的释放。

图2 培养基初始pH 值对黄芪甲苷含量的影响Fig.2 Effect of fermentation pH on the content of astragaloside IV

2.1.3 发酵温度对黄芪甲苷含量的影响

由图3可知，发酵温度对黄芪甲苷含量的影响较小，当温度为30 ℃时黄芪甲苷含量为最大，温度继续升高黄芪甲苷含量略有下降。微生物代谢产物的生成，都需要各种酶来催化。温度是影响酶活性的重要因素，温度升高，酶活反应速度加快。但是，酶也易因温度过高而失去活性，影响物质的产量。此外，这种趋势产生的原因可能也与30 ℃为沼泽红假单胞菌的最适生长温度，过高或过低的温度都不利于其生长，进而影响黄芪甲苷的释放。

图3 发酵温度对黄芪甲苷含量的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the content of astragaloside IV

2.1.4 菌种接种量对黄芪甲苷含量的影响

由图4可知，菌种接种量对黄芪甲苷的含量影响较小，在菌种接种量为6%～12%之间时，增加接种量对黄芪甲苷含量无显著影响。因此，在本着资源节约，充分利用的原则，选择菌种接种量时应控制在6%左右。

图4 接种量对黄芪甲苷含量的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on the content of astragaloside IV

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，设计了四因素、三水平的正交试验，采用L9（34）方案设计，以得出沼泽红假单胞菌发酵黄芪的最佳发酵条件。由表2 和表3可知，4个因子对黄芪发酵液中的黄芪甲苷含量均产生了极显著性的影响（P＜0.01），但各因子的影响程度不相同。根据F 值水平将各因子对黄芪甲苷含量的影响强弱排序为：菌种接种量＞培养基初始pH 值＞发酵时间＞发酵温度；最佳发酵条件是A2B1C2D3，即发酵时间为5 d、培养基初始pH 值为6.6、发酵温度为30 ℃和菌种接种量为10%。在此发酵条件下得到黄芪甲苷含量达到了22.88 μg·mL-1，比未发酵黄芪中黄芪甲苷含量提升63.9%。

表2 沼泽红假单胞菌发酵对黄芪甲苷含量影响的正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal test for the influence of Rhodopseudomonas palustris fermentation on the content of astragaloside IV

表3 沼泽红假单胞菌发酵对黄芪甲苷含量影响的方差分析Table 3 Variance analysis of the influence of Rhodopseudomonas palustris fermentation on the content of astragaloside IV

3 讨论

中药发酵技术就是在适当的接种量、温度、时间和湿度等条件下对中药进行发酵，加快中药有效成分的溶出，提高中药有效成分的提取率［11］。本文利用沼泽红假单胞菌对黄芪进行发酵，较非发酵黄芪中黄芪甲苷含量提升了63.9%，这一结果与许多研究报道相一致。王士中［18］运用糙皮侧耳菌（Pleurotus ostreatus）对黄芪进行发酵，经检测发酵后黄芪甲苷含量增加，推测是由于糙皮侧耳菌丰富的酶系对黄芪中木质纤维素、半纤维素、木质素及果胶等物质进行分解利用，活性成分充分释放，使黄芪甲苷含量增加。侯美如等［5］采用产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefa⁃ciens）SSY1 菌株固态发酵黄芪，结果显示黄芪甲苷含量升高37.95%。孙豪栋［19］以突变的伞枝犁头霉（Absidia corymbifera）作为菌种进行黄芪发酵，使黄芪甲苷产率从28.3%增加到42.86%。

然而，郁帅陆等［20］运用灵芝（Ganoderma lu⁃cidum）液体种子液对黄芪固体培养基进行发酵，发现黄芪甲苷含量降低，推测可能因高温灭菌，使连接苷元和多糖的多糖苷键部分断裂，并生成非极性皂苷元，而不能经极性较大的甲醇提取到，使检测结果降低。林莎莎等［3］利用短双歧杆菌（Bifi⁃dobacterium breve）和婴儿双歧杆菌（Bifidobacteri⁃um infantis）发酵黄芪后黄芪甲苷含量降低而皂苷Ⅱ的含量升高；陈丽艳等［21］用侧耳菌（Pleurotus os⁃treatus）发酵黄芪后黄芪甲苷的含量降低了91%，并有新的物质产生。

微生物发酵是一系列的酶促反应，制约其转化的因素很多。因此，微生物发酵黄芪会受到发酵菌种、发酵成分及发酵条件等因素的影响，对其有效成分的影响也不尽相同，也具有不同的转化机制。有报道指出，沼泽红假单胞菌可以木质素为碳源［13］进行生长并对其进行分解利用，从而提高黄芪有效成分的释放，这可能是沼泽红假单胞菌发酵黄芪导致黄芪甲苷含量增加的原因之一。

中药发酵技术改善了黄芪的药效作用，为更好的利用黄芪开创了一条新的道路。但是，优良菌种的选育仍然是中药发酵技术的关键环节。黄芪甲苷是黄芪中重要的药效成分之一，对其优良发酵菌种的研究还比较欠缺。本文的研究结果，不仅丰富了发酵黄芪的菌种资源，而且为中药黄芪进一步开发利用提供了新的思路。

4 结论

发酵时间、培养基初始pH 值、发酵温度和菌种接种量对黄芪甲苷含量均产生了极显著性的影响（P＜0.01），F 值水平显示各因子影响强弱结果为：菌种接种量＞培养基初始pH 值＞发酵时间＞发酵温度；最佳发酵条件是发酵时间为5 d、培养基初始pH 值为6.6、发酵温度为30 ℃和菌种接种量为10%，黄芪甲苷含量可达到22.88 μg·mL-1，比未发酵黄芪中黄芪甲苷含量提升了63.9%。