颞叶癫痫患者外周血6种X连锁基因DNA甲基化水平变化及其与临床特征的关系

周煦，肖琳，陈增强，吴健豪，陶华，李克深

1 广东医科大学附属医院神经内科中心，广东湛江 524001；2 暨南大学附属第一医院临床医学研究中心

癫痫是神经系统常见疾病之一，除了后天环境因素和获得性疾病，遗传因素在癫痫的发生发展过程中发挥重要作用［1］。相比于常染色体上的基因突变，X 连锁遗传性癫痫相对复杂，常为癫痫性脑病或癫痫综合征，其表现形式多样，可能与遗传机制的多样性相关，涉及基因突变、甲基化、X 染色体随机失活以及嵌合体等［2-3］。近年来，X 连锁遗传性癫痫逐渐受到关注，探明其分子机制有助于拓展癫痫的病理机制。表观遗传指DNA 序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。DNA 甲基化是表观遗传的表现形式之一，在基因启动子及其邻近外显子区域的CpG 岛甲基化异常增高，可抑制相关基因转录活性，导致转录沉默，反之可导致基因表达异常增强，从而参与疾病的发生发展过程［4-5］。与经典遗传学的基因突变相比，DNA 甲基化和去甲基化可在后天根据生长发育和环境适应需要而转换，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递，非常有利于研究遗传和环境交互影响性疾病，并成为癫痫病理机制研究的重要方向之一［6］。近年来，有学者根据癫痫性脑病患者全外显子测序鉴定新发突变并对其进行功能分析，筛选出一系列癫痫致病基因，其中可见多个X 连锁基因，CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19 和WDR45［7］。考虑到颞叶癫痫是难治性癫痫的主要来源，而癫痫性脑病相关致病基因可能成为其机制研究的突破口，故本研究以上述6 个癫痫相关X 连锁基因为基础，系统评估这些基因在颞叶癫痫患者中是否受到DNA 甲基化调控，旨在为颞叶癫痫的诊治提供新线索。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集广东医科大学附属医院诊治的颞叶癫痫患者38 例（癫痫组），男18 例、女20 例，年龄（32.1 ± 14.4）岁，发病年龄（23.3 ± 16.2）岁，病程（8.8 ± 9.8）年。根据2010 年国际抗癫痫联盟制定的标准［8］，评估患者的抗癫痫药物反应，耐药14例、敏感24例。另收集同期我院健康对照38例作为对照组，男19 例、女19 例，年龄（33.4±6.4）岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究获广东医科大学附属医院伦理委员会批准，所有研究对象已获得知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：DNA 抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技公司），EZ DNA 甲基化试剂盒（美国CA 公司），HotStart Taq DNA 聚合酶（大连宝生物工程有限公司）。主要仪器：ABI 2720 PCR 扩增仪（美国ABI 公司），Eppendorf 5810R 离心机（德国汉堡公司），Agilent 2100 生物分析仪（美国安捷伦公司），cBot Cluster测序平台、高通量测序仪（美国Illumina公司）。

1.3 X 连锁基因CpG 岛的分布情况评估与提取评估X 连锁基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 启动子区及其邻近第一外显子区（-2 kb～1 kb）CpG 岛的分布情况，具体参数：观察/预测比值＞0.60，长度＞200 bp，C+G 比例＞50%。基于人类基因组GRCh37/hg19 版本（CBI37/hg19），提取CpG岛所在区域的DNA片段。

1.4 X 连锁基因CpG 岛扩增引物序列的设计 委托上海天昊生物科技有限公司，利用其内部软件设计，获得可在同一体系能够对重亚硫酸盐处理后的目的片段进行多重扩增的特异性引物19对；基于各个基因CpG 岛数量和序列长度不同，所需引物不完全相同（见表1）；根据引物长度和GC 含量等特性，利用该公司内部软件模拟优化各条引物在同一体系的配置浓度，以达到体系反应的高效率和产物的特异性。

表1 X连锁基因CpG岛扩增引物序列

1.5 X连锁基因CpG岛的甲基化检测 采用亚硫酸氢盐转化技术，由上海天昊生物科技有限公司提供技术支持。收集受试者外周静脉血3 mL，使用DNA抽提试剂盒和Eppendorf 5810R 离心机提取DNA。使用EZ DNA甲基化试剂盒，将未甲基化的碱基C转化为U。利用HotStar Taq聚合酶，以重亚硫酸盐处理后的DNA 为模板，通过ABI2720 PCR 扩增仪和特异性引物混合液扩增目的片段。使用TIANGEN 凝胶回收试剂盒，分离并提取扩增产物。用带有Index序列的引物，向文库末端引入与Illumina 平台兼容的特异性标签序列。获得带标签的文库后，利用Illumina cBot Cluster 平台和Illumina 高通量测序仪，以2×150 bp 的双端测序模式进行高通量测序。以Agilent 2100 生物分析仪进行质量控制和数据处理，获得等位基因C 和等位基因C+U 的读数，二者比值×100%即为X 连锁基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45的DNA甲基化率。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。数据结果以-x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组X 连锁基因DNA 甲基化率比较 癫痫组和 对 照 组X 连 锁 基 因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 基因甲基化率比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 两组X连锁基因DNA甲基化率比较（%，±s）

表2 两组X连锁基因DNA甲基化率比较（%，±s）

组别癫痫组对照组P n 3838 CASK 19.88±14.1712.82±14.110.033 CDKL522.64±7.0318.93±7.080.025 IQSEC24.25±2.693.42±3.120.217 MECP218.76±12.8911.84±12.270.019 PCDH1930.75±14.6924.97±13.570.079 WDR4532.29±9.3827.21±8.650.016

2.2 不同基线特征的颞叶癫痫患者X 连锁基因DNA 甲基化率比较 男性X 连锁基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 甲基化率均低于女性（P均＜0.05），不同年龄、发病年龄、病程、抗癫痫药物反应患者X 连锁基因甲基化率比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 不同基线特征的颞叶癫痫患者X连锁基因DNA甲基化率比较（%，±s）

表3 不同基线特征的颞叶癫痫患者X连锁基因DNA甲基化率比较（%，±s）

基线特征性别男女OR P入组年龄＜26岁≥26岁OR P发病年龄＜18岁≥18岁OR P病程＜5年≥5年OR P抗癫痫药物反应敏感耐药OR P n 18201919191919192414 CASK 6.73±8.3731.72±4.170.210.00019.49±14.1420.27±14.580.960.86720.89±13.2518.87±15.331.110.66716.51±14.1423.25±13.750.710.14517.82±14.4321.08±14.190.850.501 CDKL516.39±4.8028.26±2.310.580.00022.52±6.8022.76±7.430.990.91923.05±6.5722.23±7.621.040.72221.47±7.3323.81±6.710.900.31221.26±6.7423.44±7.200.910.362 IQSEC21.92±1.506.35±1.530.300.0003.97±2.424.54±2.980.870.5194.44±2.674.07±2.781.090.6823.59±2.454.92±2.820.730.1303.52±2.264.68±2.870.750.202 MECP27.01±8.8229.33±2.350.240.00018.66±12.9818.86±13.160.990.96319.88±12.3217.64±13.681.130.60115.88±13.1821.63±12.270.930.17216.80±13.4619.90±12.700.840.482 PCDH1917.32±9.7942.83±3.140.400.00030.06±15.1031.43±14.650.960.77931.72±14.1929.77±15.501.070.68827.53±14.7733.96±14.270.810.18028.51±14.6532.05±14.860.890.482 WDR4523.52±6.0540.14±1.220.590.00032.23±9.3832.35±9.641.000.96833.32±9.2431.26±9.651.070.50730.10±9.1834.48±9.300.870.15231.35±10.3132.83±8.980.950.645

2.3 不同性别健康对照人群X 连锁基因DNA 甲基化率比较 在健康对照人群中，男性X 连锁基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45甲基化率均低于女性（P均＜0.05）。见表4。

表4 男性和女性对照X连锁基因DNA甲基化率比较（%，±s）

表4 男性和女性对照X连锁基因DNA甲基化率比较（%，±s）

性别男女P n 1919 CASK 3.27± 1.1822.37±14.670.000 CDKL514.44±0.7823.43±7.740.0000 IQSEC21.55±0.255.29±3.550.000 MECP23.51± 0.5820.17±12.760.000 PCDH1915.64± 2.4034.31±13.740.000 WDR4521.39±0.4533.03±9.060.000

3 讨论

尽管新型抗癫痫药物被陆续应用于临床，大多数患者能够得到有效控制，但是仍然有约30%癫痫患者发展为耐药性癫痫［4］。一旦癫痫患者病情得不到有效控制，将严重影响其学习、生活和工作能力，并给所在家庭和社会造成严重的疾病负担。颞叶癫痫是成人癫痫最常见的发作类型，约有80%的颞叶癫痫患者抗癫痫药物治疗效果不佳，是耐药性癫痫的最主要来源。因此，本研究以颞叶癫痫患者为研究对象，积极从新的角度探索其病理机制，对于整体改善癫痫患者诊治水平具有重要意义。

X 连锁遗传性癫痫常见频繁的痫性发作，发作间期大量放电，常伴有认知和精神行为改变，病理改变包括突触异常新生、神经元迁移和分化障碍、神经递质合成和释放障碍、膜受体结构和功能障碍等［10］。X 连锁致病基因及相关癫痫发作常呈早发性、难治性甚至灾难性，常表现为癫痫性脑病和癫痫综合征。MECP2 是具有结合DNA 甲基化序列的核蛋白家族成员之一，具有抑制基因转录的生物学效应，其基因突变或缺失引起Rett 综合征［11-12］。CDKL5 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在神经发育中发挥重要作用，其基因突变可导致新生儿在数周内表现出耐药性癫痫，在临床上与X 连锁West 综合征和Rett 综合征密切相关［13］。CASK 是钙依赖丝氨酸蛋白激酶，在脑内突触区域富集，该蛋白基因编码序列第21 外显子区移码突变c.1896dupC＜p.C633fs（*）2可导致患者自幼癫痫成簇发作，抗癫痫药物难以有效控制［14］。IQSEC2是鸟嘌呤核苷酸交换因子，在兴奋性神经元突触后膜上发挥作用，其基因功能缺失突变可导致X 连锁智力障碍和早发性癫痫［15］。PCDH19 是主要表达于脑内的钙依赖细胞黏附蛋白，其基因突变表现为儿童起病的短暂而成簇的惊厥发作，伴有认知损害和行为异常［16］。WDR45 是WD 重复片段蛋白家族成员之一，参与细胞周期、信号转导、凋亡和基因表达调控等生物学活动，多个位点基因突变可导致患者发育迟缓和癫痫发作［17］。本研究纳入的6 个癫痫相关X 连锁基因均已通过外显子检测，确认其癫痫致病性，但是否存在其他遗传调控机制参与尚不清楚。因此，本研究从DNA 甲基化角度，初步明确癫痫相关X 连锁基因是否和颞叶癫痫表型相关，为颞叶癫痫病理机制研究提供新的突破口。

本研究系统评估了癫痫相关X连锁基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 的DNA甲基化水平与颞叶癫痫表型的关系，发现这些基因的DNA 甲基化率在癫痫组和对照组间无统计学差异，提示上述X 连锁基因在颞叶癫痫中很可能不受DNA 甲基化的表观遗传调控。进一步对不同基线特征的颞叶癫痫患者进行分析比较，发现CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 的DNA甲基化率在女性患者中均显著降低；而且在健康对照人群中，这些基因的DNA 甲基化率也有类似表现。这提示上述X 连锁基因DNA 甲基化与性别密切相关。已有研究显示，X 连锁基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 在颞叶癫痫患者和正常人群中均未表现出性别相关的表达差异［18-19］，因此认为，X 连锁基因DNA 甲基化率在性别间的差异不会导致基因表达的差异，故而对疾病的表型应该无影响。

实际上，X 连锁基因在两性间存在拷贝数差异：男性X 染色体只有1 个拷贝，女性X 染色有2 个拷贝，故而相对于常染色体基因，X 连锁基因具有独特的调控机制，例如剂量补偿和减数分裂性染色体沉默［20］，但是其具体机制尚未明了。本研究通过对颞叶癫痫患者和正常对照的亚组分析，推测女性患者X 连锁基因相对较高的甲基化率，有助于女性患者X 染色体双拷贝基因的代偿性沉默，以维持其在两性间相似的表达水平和生理功能，这为X 连锁基因在两性间的表达调控机制提供了新的线索。

综上所述，X 连锁基因在颞叶癫痫中很可能不受DNA 甲基化的表观遗传调控，但是X 连锁基因DNA 甲基化率在女性患者和女性健康对照者中，分别较男性患者和男性健康对照者升高，这为DNA 甲基化参与女性X染色体沉默调控提供了线索。值得注意的是，细胞和组织的分化和功能实现与DNA 甲基化的调控密切相关，故而DNA 甲基化在一定程度上存在细胞和组织特异性［21］。而本研究基于外周血液样本，缺乏脑组织样本，相关结果未能在脑组织中验证；且因基于单中心、小样本，相关结果是否具有广泛适用性尚待验证。