酶联免疫吸附法和免疫亲和柱-高效液相色谱法在检测饲料中黄曲霉毒素B1含量中的比对研究

段春宇

摘要： 为了探讨酶联免疫吸附法检测饲料中黄曲霉毒素B1含量的可行性，试验采用酶联免疫吸附法（ELISA法）比对免疫亲和柱-高效液相色谱法（IAC-HPLC法），对饲料中黄曲霉毒素B1含量进行了检测，对检测结果的准确度、精密度和样品加标回收率进行了分析。ELISA法线性方程相关系数为0.9952，相对标准偏差（RSD）为1.6%～8.1%，平均加标回收率为105.6%～111.8%。结果表明，ELISA法的准确性、重现性、稳定性好;且ELISA法检测结果与IAC-HPLC法检测结果的相对标准偏差（RSD）为5.4%～19.2%，两种方法的检测结果的偏差可以接受，表明ELISA法能满足检测需求。

关键词：酶联免疫吸附法;免疫亲和柱-高效液相色谱法;饲料;黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素，是黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次级代谢产物，主要分为B、G类，其中黄曲霉毒素B1的含量最多，危害性最大，该毒素具有强致癌性、致畸性、致突变性。黄曲霉毒素B1可以侵害畜禽肝脏，导致肝脏变性、坏死等，进而导致畜禽肺脏、肾脏、脾脏、胃、直肠等器官发生病变;导致畜禽的免疫力降低;导致畜禽生长发育迟缓，采食量降低、食物利用率低;母畜不育或产仔少等问题。

黄曲霉毒素B1主要污染粮食作物及其副产品，其中，花生和玉米及其副产品污染最为严重，几乎无法避免，该毒素性质稳定，持续高压灭菌2h仅能降低其25%～33%的毒力，而且只有在282℃的高温下才能被裂解，所以世界各国都严格设定“限量标准”。黄曲霉毒素B1污染饲料主要源于原料污染、储存条件不当饲料霉变污染和加工过程污染。要预防黄曲霉毒素B1毒害畜禽，就要及时准确测定饲料原料及饲料成品中黄曲霉毒素B1含量，因而制定准确实用的检测方案至关重要，进而加强原料的筛选、饲料的品控，更好的保护畜禽健康，发挥畜禽生产性能，将饲料价值充分发挥。

饲料中黄曲霉毒素B1的检测方法较多，有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析快速检测试纸条等，本文采用免疫亲和柱-高效液相色谱法和酶联免疫吸附法检测饲料原料和成品中黄曲霉毒素B1的含量，并通过比对分析，确定ELISA法检测饲料中黄曲霉毒素B1含量的可行性。

2 免疫亲和柱-高效液相色谱法材料与方法

2.1 试剂与耗材

甲醇（色谱纯，默克公司）、黄曲霉毒素B1标准品（Sigma公司）、黄曲霉毒素免疫亲和柱（ROMER公司）、氯化钠（分析纯）、玻璃纤维滤纸等。

2.2 主要仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪配荧光检测器、光化学衍生器、高速万能粉碎机、高速混匀器、固相萃取仪等。

2.3 方法

1）标准溶液的配制 黄曲霉毒素B1标准品（Sigma公司），原液浓度为20μg/mL，用甲醇溶液逐级稀释成100ng/mL的工作液。再用流动相分别稀释成0.10、0.50、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0ng/mL的标准工作液。

2）样品前处理 试样制备参照GB/T 20195—2006，用高速万能粉碎机研磨后过1mm孔筛，混匀，储存于封闭容器，避光低温保存，待检。称取50.0g待检样品于250mL具塞锥形瓶中，加入5g氯化钠和125.0mL的甲醇水（70+30）溶液混匀，振荡器200rpm/min震荡30min，定量滤纸过滤后，准确移取10.0mL滤液，加入20.0mL超纯水稀释混匀，玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，收集滤液于干净离心管中做上样液。

将免疫亲和柱连接于10.0mL的玻璃定量管下，取15.0mL上样液，过免疫亲和柱，流速1～2drop/s;待柱内液体排干后，分别两次用10.0mL超纯水清洗柱子，流速2～3drop/s;待柱内液体全部排干后，增大泵压，抽干免疫亲和柱内液体，用1.0mL甲醇洗脱柱子，流速自然重力，直至2～3mL空气通过柱子，收集全部洗脱液于玻璃定量管中，加超纯水定容为2.0mL。定容后的洗脱液用0.22μm的有机微孔过滤器过滤到样品瓶中，待检。

3）色谱条件 色谱柱：Agilent C18色谱柱（规格：150×4.6mm，粒度5μm）;流动相：超纯水+甲醇+乙腈（60+20+20）等度洗脱;流速：1.0mL/min;FLD波长：激发波长360nm，发射波长440nm;柱温40℃;进样量：50μL。

采用外标法，根据样品峰保留时间进行定性，峰面积进行定量分析。

3 酶联免疫吸附法材料与方法

3.1 试剂与耗材

黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒（ROMER公司）、超纯水、针式过滤器。

3.2 主要仪器

酶标测定仪：内置450nm滤光片、回旋振荡器、涡旋振荡器、微量移液器等。

3.3 方法

1）样品前处理 称取20.0g样品于250mL具塞锥形瓶中，加入100.0mL甲醇水（70+30）溶液提取，置于回旋振荡器上震荡萃取3min，静置样品，定性滤纸过滤。用1mol/L的NaOH和HCl微调滤液pH 6～8，如果样品酸性比较强，可以使用高浓度的酸碱进行调节，尽量减少酸碱的用量。用试剂盒提供分析缓冲液1：1稀释滤液，于1mL离心管中，用涡旋振荡器混匀，待测。

2）试剂盒操作过程 实验室温度控制在20～25℃，从冰箱中拿出试剂盒，取出试剂盒中所有试剂回温2～3h;用八道移液器取（綠色瓶盖）酶联偶合物200μL，放入绿色预混合板中;单道移液器分别取100μL各浓度标准品和样品，放入以上预混合板中，用八道移液器混合四次（注意溶液不要溢出，防止各孔污染）;将孔板进行编号，以便记录标准品、样品位置，用八道移液器将上述混合液100μL转移至抗体包被的孔中，室温避光孵育15min，转移过程中不要有气泡;蒸馏水清洗4次拍干（清洗时各孔不要相互污染），用洗瓶冲洗时，不要直接冲洗孔，侧着清洗，防止底部的物质冲出，清洗后轻甩一下，在吸水纸上快速拍干孔板，不要大幅度用手甩板，孔板中没有液滴即可;拍干后，用八道移液器每孔加入（蓝色瓶盖）底物100μL;室温光孵育5min;时间到后，用八道移液器每孔加入（红色瓶盖）终止液100μL，轻轻摇匀后检测;将孔板转移到酶标仪450nm（带630nm示差波长）读取每孔的吸光度值。

4 结果与分析

4.1 结果

本研究选用空白玉米进行加标回收试验，样品名称加标1、加标2和加标3，黄曲霉毒素B1添加浓度分别为10.0、20.0和50.0μg/kg，选取花生粕、玉米胚芽粕、奶牛配合饲料样品各一个，分别用IAC-HPLC法和ELISA法各重复3次试验。结果见表1。

1）免疫亲和柱-高效液相色谱法的工作曲线、准确度、精密度 标准系列经上机检测，以测得峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，得到黄曲霉毒素B1标准品的峰面积（Y）的线性方程Y=10.00282X-1.71180，相关系数为0.99976，表明在0.10 ～50.0ng/mL范围内，线性关系良好。加标回收试验和重复性试验是验证方法准确度和精密度的重要手段。按上述IAC-HPLC法试验方法，测试结果见表1。本结果的平均加标回收率为93.0%～99.0%，相对标准偏差（RSD）为0.8%～4.8%。说明此方法准确度高，稳定性好。黄曲霉毒素B1的标准样品色谱图及待检样品色谱图分别见图1和图2。

2）酶联免疫吸附法的准确度、精密度 试剂盒标准系列经上机检测，在ROMER公司提供计算软件上计算结果，线性方程相关系数为0.9952，表明在0.10 ～50.0ng/mL范围内，线性关系良好。按上述ELISA法试验方法，测试结果见表1。本结果的平均加标回收率为105.6%～111.8%，RSD为1.6%～8.1%。ELISA法的准确度高，稳定性可以接受。ELISA法检测结果与IAC-HPLC法检测结果的RSD为5.4%～19.2%，两种方法结果的偏差表明ELISA法准确度可以接受。

4.2 分析

使用IAC-HPLC法和ELISA法分别对饲料样品进行检测，通过表1数据结果可以看出，IAC-HPLC法测值均小于ELISA法，IAC-HPLC法前处理过程需要过免疫亲和柱，在过柱过程中，黄曲霉毒素B1没有全部收回，有微量损失，从而导致整体检出率偏低。ELISA法检测结果与IAC-HPLC法检测结果的RSD为5.4%～19.2%，其中当样品中黄曲霉毒素B1含量≥10μg/kg時，两种方法结果的RSD为5.4%～9.0%，只有奶牛配合饲料黄曲霉毒素B1含量较低时，两种方法结果的RSD值偏差较大，分析原因一是IAC-HPLC方法在过柱过程中，黄曲霉毒素B1有损失对检测结果影响较大，二是ELISA法检测低含量黄曲霉毒素B1时，存在假阳性的情况。而且随着黄曲霉毒素B1浓度增加，两种方法结果的重复性呈现良好趋势。因此，ELISA法检测饲料中黄曲霉毒素B1含量准确度较高，可以用于饲料中黄曲霉毒素B1批量检测。

5 结论

综上所述，ELISA法准确度高、稳定性好，能够满足日常监测的需求。与IAC-HPLC法相比，ELISA法不需要对样品进行免疫亲合柱过柱等复杂的前处理，且ELISA法可以同时检测多个样品，有效的提高了检测效率，节省了检测成本，可以作为日常批量监测的首选方法。因IAC-HPLC法检测结果可靠性强、可以有效避免样品检测的假阳性情况，因此，在实际检测过程中可以采用ELISA法对大批量饲料样品中黄曲霉毒素B1进行初筛快速测定，再采用IAC-HPLC法对疑似超标阳性样品进行定量确认检测。