HPLC测定蒲公英中4种有机酸含量并优化提取纯化工艺

＊王倩楠 石锦峰 郑家勤 王晗毓 董自波,2*

（1.江苏海洋大学药学院 江苏 222005 2.海洋药用资源开发工程研究中心 江苏 222005）

引言

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）属多年生草本植物，广泛分布于我国西南和西北等地区，是一种药食同源的中药材资源[1]。现代研究表明，蒲公英富含有机酸、黄酮、多糖、甾醇、三萜等有效成分[2-3]。蒲公英有机酸包括绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、单咖啡酰酒石酸、阿魏酸等，具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[4]。此外，菊苣酸还能降脂、降糖、提高人体免疫力[5]。蒲公英临床可用于胃溃疡和上呼吸道感染等疾病治疗[6]。作为产量大、价廉易得的中药，优化提取纯化工艺，可加大利用率，提高经济和社会效益。

1.仪器与材料

(1)材料

蒲公英购自安徽井泉中药股份有限公司；单咖啡酰酒石酸、绿原酸、菊苣酸、咖啡酸（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8大孔树脂购自北京索莱宝科技有限公司；Agileant-XDA-8 C18柱购自安捷伦科技有限公司；超纯水、蒸馏水自制；甲醇、乙腈为色谱级；其余试剂为分析纯。

(2)主要仪器

岛津DGU-20A3R高效液相色谱仪；UV-1800PC型紫外可见分光光度计；ES1035A型电子分析天平；FRQ-1010HT型数控超声波清洗机；KMD型加热套；Spring-R30型超纯水仪。

2.方法与结果

(1)绿原酸、咖啡酸、菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的含量测定

①色谱条件

色谱条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸-0.04%三乙胺-0.02%二正丁胺溶液，梯度洗脱（0～4min 5%～10%A；4～12min 10%～20%A；12～21min 20%～40%A；21～23min 40%～50%A；23～24min 50%～5%A；24～29min 5%A），流速1.0mL·min-1，检测波长为328nm，柱温35℃，进样量10μL。

②对照品与供试品的制备

精密称取菊苣酸、咖啡酸、绿原酸与单咖啡酰酒石酸对照品于容量瓶中，70%甲醇超声后定容至刻度；另精密吸取对照品储备液置于同一量瓶后定容，制成含菊苣酸、咖啡酸、绿原酸与单咖啡酰酒石酸83.62μg/mL，20.36μg/mL，9.46μg/mL和101.8μg/mL的混合对照品。取蒲公英提取物于容量瓶中，加入70%甲醇超声15min后定容，取续滤液作为供试品溶液。

③系统适用性研究

精密吸取“2.1.2”项下制备的混合对照品与供试品溶液，于“2.1.1”项下色谱条件下进样并记录色谱图1。

图1 HPLC对照品

④线性关系考察

精密量取混合对照品1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL置20mL容量瓶后定容，进样1次。以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制。单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的回归方程分别为：y1=14700x-11272（R1=0.9997）、y2=80568x-3794.9（R2=0.9992）、y3=58958x+12381（R3=0.9996）和y4=24413x-14939（R4=0.9998）。结果表明，单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸质量浓度分别5.09～50.9μg，0.47～4.73μg，1.02～10.18μg和4.18～41.81μg的范围内线性关系良好。

⑤精密度试验

取同一份对照品溶液，按“2.1.1”项色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸峰面积的RSD分别为0.27%，0.86%，0.21%，1.65%（n=6），RSD＜2%，符合规定，表明仪器精密度良好。

⑥稳定性试验

取同一份供试品溶液，室温下放置0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h后分别进样，单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸RSD分别为1.72%，0.46%，0.07%，0.16%（n=8），RSD＜2，符合规定，说明24h内稳定性良好。

⑦重复性试验

取同一份供试品溶液平行制备6份，分别进样1次，计算单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的含量和RSD为1.57%，1.48%，1.03%，1.80%，RSD＜2%，表明该方法重复性良好。

⑧回收率试验

精密称取1mL蒲公英纯化物，共6份，并加入单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸对照品储备液，按“2.1.2”项下方法制备加样供试液，进样1次，计算加样回收率。结果得单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的平均回收率为100.97%，97.46%，101.54%，99.62%，RSD分别为0.85%，1.76%，0.93%，0.32%，该方法准确度好。

(2)纯化工艺研究

①树脂的预处理与上柱液的制备

将NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8树脂用95%乙醇浸泡24h，充分溶胀后湿法装柱，用95%乙醇洗脱直至流出液无白色浑浊后，水洗至无醇味。取40g蒲公英热水提取，第一次加水15倍，提取1.5h，第二次加水12倍，提取1h，合并滤液，即得。

②大孔吸附树脂筛选

锥形瓶中加入20mL大孔树脂与40mL上柱液，室温震荡24h，测定续滤液、乙醇洗脱液中单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的量，计算吸附率、解吸率、吸附量，以菊苣酸和单咖啡酰酒石酸为主比较，结果如表1、表2所示，优选DA201树脂。

表1 5种大孔树脂的吸附率（%）与吸附量（μg/mL）

表2 5种大孔树脂的解吸率（%）

③最大吸附量考察

取树脂25mL，上柱液150mL，以2.0BV·h-1流速进行吸附，分段收集流出液，每5mL测定蒲公英总有机酸的峰面积，以编号为横坐标，计算质量浓度为纵坐标，绘制泄露曲线。结果如图2所示，在第22份出现明显的泄露行为，除去残留水体积14mL，总上柱量为96mL，即1mL DA201树脂可以吸附3.8mL的蒲公英提取液。

④吸附流速考察

取DA201树脂25mL，上柱液100mL，分别以0.5BV·h-1、1.0BV·h-1、1.5BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1流速进行吸附。收集流出液后，检测4种有机酸的峰面积，计算有机酸含量与吸附率。结果如表3所示显示，随着流速加快，吸附率越小，表明树脂交换率下降，流速过慢则时间成本增加，不利于工厂生产，故选1.5BV·h-1为最佳流速，即保障有机酸富集量最大又提高效率。

表3 不同吸附流速下的吸附率（%）比较

⑤洗脱流速的考察

取上样液按照最佳条件吸附后，用3BV 50%乙醇以1.0BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1、4.0BV·h-1、5.0BV·h-1流速进行洗脱，收集解吸液，按照“2.1.2”项目下进行制样，测定蒲公英4种有机酸含量，计算解析率。结果显示，4种有机酸含量先增加后降低，解析率随洗脱流速的加大而下降，结合提取效率与结果综合分析，2.0BV·h-1为最优洗脱流速。

⑥洗脱溶剂浓度考察

取大孔树脂并按上述条件吸附后，将30%、50%、80%、95%乙醇以2.0BV·h-1流速进行洗脱，用量为3BV，测定洗脱液里各有机酸含量。如表4所示，乙醇浓度为80%时，洗脱物中总有机酸含量最高。

表4 5种大孔树脂解吸液的浓度（mg/g）

⑦洗脱溶剂体积考察

取DA201树脂吸附后，用10BV 80%的乙醇进行洗脱，流速2.0BV·h-1，每1BV分段收集，测定菊苣酸的含量并计算累计解析率，以流份为横坐标，累积解吸率为纵坐标作解吸曲线。由图2可知，5BV的乙醇可将有机酸基本解吸完全，确定洗脱液体积5BV。

图2 总有机酸的泄露曲线

图3 菊苣酸的泄露曲线

⑧验证实验

取25mL DA201树脂和125mL提取液，以1.5BV·h-1流速进行吸附和4BV水洗后，最后用5BV 80%乙醇以2BV·h-1的流速洗脱，平行3次。菊苣酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、绿原酸平均质量浓度分别为2.8752mg/g、0.8167mg/g、0.3407mg/g、0.1469mg/g，有效成份大幅提高，吸附与洗脱良好。

3.讨论

我国蒲公英分布广泛、产量大、价廉易得，对其提取分离纯化工艺进行优化，加大其利用率，可以提高其经济效益。本实验以蒲公英4种有机酸为指标，优选DA201大孔树脂，上样体积为4BV，吸附流速为1.5BV·h-1，4BV洗涤用水量，5BV 80%乙醇以2.0BV·h-1的流速洗脱，纯化后，4种有机酸含量大幅提升，效果良好。