一种新型植物乳杆菌素的分离纯化研究

＊王金泽 刘哲 黄一刚 裴金金,2,3,4*

（1.陕西理工大学 生物科学与工程学院 陕西 723000 2.陕西省资源生物重点实验室 陕西 723000 3.陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心 陕西 723000 4.陕西理工大学秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室（培育） 陕西 723000）

细菌素具有优势，因为它们无毒、高抗菌活性和良好的选择性[1]。因此，它们有望在食品工业中用作抗菌剂/防腐剂[2]。驯养牦牛在青海省已经饲养了数千年。牦牛干酪含有不同的微生物含量，这取决于原产牛奶和发酵环境的不同。因此，它可能是细菌素产生菌分离的理想来源。尽管从许多其他来源[3]分离出细菌素已有报道，但目前从青海牦牛乳干酪中分离到细菌素的报道还很少。本研究从青海牦牛乳干酪分离株Lb的上清液中分离纯化出一种新的细菌素植物乳杆菌素SLG1，命名为Lb.植物乳杆菌SLG1。在本研究中，我们还对植物乳杆菌素SLG1的理化性质进行了表征。

1.材料与方法

(1)产细菌素乳酸菌(LAB)的筛选

①乳酸菌（LAB）的分离

传统的青海牦牛奶酪是从当地市场购买的。然后将牦牛奶酪切成20g/片，并将它们均化至均匀。然后将奶酪加入100mL MRS肉汤中并在30℃温育。温育24h后，使用培养环将液体悬浮液涂在MRS板上。将革兰氏阳性且过氧化氢酶阴性的菌暂定为乳酸菌（LAB）[4]。无细胞上清液（CFs）是通过离心和0.26mm微过滤器过滤获得的[5]。以金黄葡萄球菌指示菌株CICC10384为指示菌株，采用牛津杯法测定CFS对金黄色葡萄球菌的抗菌活性[6]。

②产细菌素乳酸菌的鉴定

使用鉴定试剂盒（API 50CHL，BioMerieux，法国Montalieu Vercie）根据菌株的碳水化合物发酵模式进行初步鉴定[4]。采用27F和1492R引物通过16SrRNA基因序列分析对该细菌菌株进行基因型鉴定[7]。然后将序列提交给NCBI使用BLAST进行分析，来比较相似性。

(2)菌株SLG1生产细菌素的研究

将细菌素产生菌接种于MRS培养基，30℃培养，每隔4h测定一次抗菌活性和pH值。

(3)细菌素的提纯

①纳米磁性脂质体的制备

铁磁性Fe3O4纳米颗粒是用水热方法制备的[8]。将蛋黄磷脂酰胆碱（EYPC，最低98%纯度）和1,2-dimyristoylsn-glycerophosphatidylglycerol（钠盐，最低97%纯度）（2:1，w/w）溶解在氯仿/甲醇（2:1，v/v）中，用薄膜分散法制备纳米磁性脂质体颗粒[9]。

②细菌素的筛选与纯化

将细菌素产生菌的胞外发酵液与磁性脂质体在30℃下混合24h，将细菌素吸附到磁性脂质体中，以含50mM NaCl的PBS（pH7.2，10mm）为等度流动相，在25℃下分离磁性脂质体中的细菌素，在215nm处测定吸光度。收集具有吸收峰的洗脱组分，并用牛津杯法分析其抗菌活性[6]。蛋白质浓度用Brodf定量[5]进行测试。收集活性最高的洗脱液。采用高效液相色谱法（Waters Symmetry C18柱，250±4.6mm，5mm，爱尔兰都柏林）梯度分离（流动相B：5e 100%），流速0.5mL/min，25℃，流动相（A）0.05%（v/v）三氟乙酸（TFA）和流动相（B）100%乙腈。

(4)结构特征

对纯化的细菌素进行氨基酸序列测定（Procise491，ABI，USA）。使用NCBI BLAST算法进行同源性搜索。用HyperChem7.5软件预测细菌素的三维结构。

(5)细菌素的抗菌活性及其特性研究

针对表1中列出的指示菌株测试了细菌素活性。MIC为最小抑菌浓度，即最低抑菌浓度，在微生物鉴定的稀释法中以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度。MBC为最小杀菌浓度，即杀死99.9%（降低3个数量级）的供试微生物所需的最低药物浓度。并采用扫描电镜对比观察经细菌素处理和未经细菌素处理的金黄葡萄球菌的形态，研究细菌素的抗菌活性及抗菌机理。

表1 细菌素的抗菌活性

续表

2.结果与分析

(1)SLG1菌株的分离与鉴定

从青海牦牛干酪中分离到17株潜在的实验室菌株。通过调节上清液的pH至6.5并检测其抑菌活性，排除了有机酸对实验室细菌生长抑制活性的可能性。从中筛选出9株细菌素产生菌。由于SLG1菌株能同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（金黄色葡萄球菌CICC10384的生长），本研究选择该菌株进行进一步研究。根据API 50CHL系统和16SrDNA鉴定表明，SLG1菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌SLG1。

乳酸菌产生的细菌素由于其安全的性质和高的抑菌活性，近年来引起了人们的极大关注。此外，牦牛奶制成的奶酪被认为可以治疗胃炎疾病，还含有各种各样的微生物群落[10]。因此，它可能是分离细菌素产生菌的一个潜在来源。

(2)细菌素的产生

植物乳杆菌SLG1是在对数生长期产生的，最高产量出现在稳定期中期（从27h到36h）。这表明植物素SLG1的产生依赖于细胞数量，它可能是一种次生代谢物。在一些实验室细菌素中也观察到了类似的结果，如植物乳杆菌2a产生的细菌素2a，由乳酸链球菌产生的细菌素R1333。

(3)细菌素的纯化

从磁性脂质体中洗脱出三个组分，洗脱液#3显示最高的抗菌活性，然后使用RP-HPLC从洗脱液#3中纯化获得细菌素SLG1。乳酸菌细菌素的传统方法通常涉及复杂的色谱过程[11-12]，虽然有效，但过于复杂，通常涉及三个以上的净化步骤。例如，细菌素R1333是从乳酸菌的上清液中提纯出来的，经硫酸铵沉淀、凝胶过滤、反相高效液相色谱（RPHPLC）分离。人们认为，所有细菌素，无论其作用机制如何，都需要与目标细菌细胞膜交换才能发挥活性[13]。基于这一观点，本研究旨在利用磁性脂质体吸附和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两步法快速筛选能够与菌膜结合的抗菌肽，作为一种简便有效的纯化方法。

(4)植物乳杆菌素的结构特征

细菌素SLG 1的10个氨基酸序列被成功鉴定为Tyr-GlyAsn-Gly-Val-Phe-Ser-Val-Ile-Lys。当尝试进行NCBI BLAST同源性分析时，未检测到与任何已知肽的相似性。因此，该细菌素被确定为一种新的多肽，命名为植物乳杆菌素SLG1。用生物信息学工具预测其结构，结果如图1所示，成无规则卷曲状态。据报道，许多细菌素在水溶液中具有随机卷曲状态[9]，这种结果可能使其更容易插入细菌细胞膜。

图1 用HyperChem7.0软件计算得到的植物乳杆菌素SLG1的三维结构

(5)植物乳杆菌素SLG1的抗菌活性及其特性研究

植物乳杆菌素SLG1对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色微球菌、嗜热梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌、金黄色葡萄球菌、无毒李斯特菌和白纹伊氏菌均具有良好的抗菌活性（表1）。扫描电镜观察结果显示，经细菌素SLG1处理后的金黄葡萄球菌细胞皱缩、破裂，细胞内容物流失从而导致细胞死亡。说明SLG1可通过作用敏感菌细胞膜，造成胞膜通透性增加，细胞结构破坏的方式发挥其抗菌机制。

图2 植物乳杆菌SLG1(2MIC)对敏感微生物细胞形态的影响

3.结论

本研究从牦牛奶干酪中分离筛选获得细菌素产生菌植物乳杆菌SLG1。建立磁性脂质体吸附结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）的有效纯化细菌素的新方法，并纯化获得一种新型细菌素，命名为植物乳杆菌素SLG1。其氨基酸序列为YGNGVFSVIK。该细菌素对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色微球菌、嗜热梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌、金黄色葡萄球菌、无毒李斯特菌和白纹伊氏菌具有良好的抗菌活性。此外，植物乳杆菌素SLG1可以增加细胞膜的通透性，导致孔洞形成和最终细胞死亡。最后，这种细菌素具有作为一种有前途的抗菌剂的潜力，可用于进一步的食品或医疗应用。