非洲猪瘟病毒特性

2022-05-30 10:48孟祥光王祎汀
国外畜牧学·猪与禽 2022年4期
关键词:复制非洲猪瘟消毒剂

孟祥光 王祎汀

摘 要:非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种病毒性出血性疾病,对家猪和欧亚野猪具有极高的致死率。在过去的十年中,非洲猪瘟已经传入欧洲和亚洲许多国家或地区的猪群中,现今已经发展成空前的流行势态。在此背景下,本文从非洲猪瘟病毒的归属、特征、活力稳定性、遗传多样性和分型等角度介绍了病毒的特性、复制机制以了解非洲猪瘟病毒如何进行复制,以及对哪些类型的消毒剂敏感——对脂类溶剂、洗涤剂以及氧化剂敏感,并归纳了与ASF相关的有争议的观点以及知识空白。

关键词:非洲猪瘟;病毒特性;复制;消毒剂

中图分类号:S852.65+ S851.33 文献标志码:B 文章编号:1001-0769(2022)04-0001-07

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种病毒性、出血性疾病,对家猪和欧亚野猪具有极高的致死率。尽管引发该病的病毒非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的宿主范围有限,也不可能引发人畜共患病,但其对社会、经济的影响巨大,许多利益相关者都被牵涉其中。出于这个原因,一旦猪群暴发该病,发病地所在行政管理部门应向世界动物卫生组织(Word Oranisation for Animal Health,OIE)通报。在最坏的情况下,ASF会涉及到家猪、野生动物的病毒贮藏宿主(即野猪)、无生命的寄生体(如猪的尸体、被污染的栖息地、畜牧生产工具、其他机械载体)以及活的节肢动物载体(如软蜱)。非洲猪瘟控制仍依赖于严格的卫生措施,因为目前既没有获得许可的疫苗,也没有任何有效的治疗方法。

2007年,起源于撒哈拉以南非洲森林循环(sylvatic cycle)中的ASF传入格鲁吉亚,随后跨高加索地区侵入俄罗斯。该病毒进一步传播,在2014年传入欧盟。2018年8月,ASFV传入世界上最大的生猪生产国——中国,目前该病毒正在亚洲一些国家或地区的猪群中蔓延。最近受影响的国家是澳大利亚和与之相邻的巴布亚新几内亚,以及2020年暴发ASF的印度。因此,在过去的13年,ASF发生了空前绝后的传播,并得到了各国或各地行业管理部门空前重视,目前的大流行甚至影响到了毫不相关的行业。亚洲的非洲猪瘟疫情暴露了当地兽医和农业行政管理部门在防控方面的弱点,也暴露了养猪业与副产品回收使用之间的各种直接和间接联系。非洲猪瘟疫情不仅导致肝素以及用于食品和糖果生产的明胶的供应受到影响,而且还导致动物脂肪、皮和毛的利用受到影响。此外,如果不小心将猪源性产品作为养猪生产中猪蛋白质营养的来源,那么这些产品将会成为ASF的“加速器”。

在此背景下,本文力图总结现有数据,特别是在过去5年中获得的知识,并就主要的知识空白进行归纳总结。对于后者,笔者借鉴了全球非洲猪瘟研究联盟最近的差距分析报告(2018年的报告可在网上查阅:https://www.ars.usda.gov/GARA/reports.htm)。

1  病毒特性

1.1 ASFV的特征和复制

ASFV是一种大型双链DNA病毒,属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)。根据国际病毒分类委员会2019年的分类公告(EC 51,德国柏林,2019年7月),非洲猪瘟病毒科已被纳入痘疹病毒纲(Pokkesviricetes)、阿福病毒目(Asfuvirales)。除了这一官方命名外,人们还讨论了将ASFV纳入暂定的巨型病毒目(Megavirales),该目包含单源但异质的核胞质大DNA病毒(nucleo-cytoplasmatic large DNA viruses,NCLDV)支目。该暂定目还包括痘病毒科(现在属于Chitovirales新目)、Iridoviridae科(现在属于Pimascovirales目)、Asfarviridae科、Phycodnaviridae科(现在属于Algavirales目)、Mimiviridae科(现在属于Imitervirales目)、Ascoviridae科(现在属于Pimascovirales目)和Marseilleviridae科(现在属于Pimascovirales目)。由于新的巨型病毒不断被发现,如潘多拉病毒(Pandoraviruses)、福斯特病毒(Faustoviruses)、軟体病毒(Molliviruse)、高茅巴病毒(Kaumaoebavirus)、塞德鲁特病毒(Cedratviruses)以及帕克曼病毒(Pacmanvirus),这组病毒在不久的将来可能会增加新成员,命名法则仍在讨论中。

ASFV结构非常复杂,直径为175~   215 nm。到目前为止,研究认为,ASFV由一个核蛋白核心(直径70~100 nm)、一个由内部脂质层包围的核心壳、一个具有        1 892~2 172个帽状体的二十面体蛋白衣壳和一个可有可无的脂质包膜组成。然而,有关ASFV结构和构造的详细情况仍不清楚。

最近,ASFV粒子三维结构单粒子的低温电镜分析结果显示,病毒核心(病毒基因组和相关蛋白,即DNA结合蛋白p10、pA104R和部分转录机制复合物)实际上被两个不同的二十面体蛋白衣壳和两个脂蛋白膜包围。一个是围绕着对称性二十面体的内壳;一个是外层,源于出芽过程(budding process)。内蛋白层以T=19衣壳的形式组织,限制了该核心壳。它包含来自病毒多聚蛋白pp220(p5蛋白、p14蛋白、p34蛋白、p37蛋白和p150蛋白)和pp62(p35蛋白、p15蛋白和p8蛋白)的多个蛋白质。鉴于β链的含量,p15蛋白可能是该层的主要衣壳蛋白。外层衣壳[T=277的三角(triangulation)分数]形成一个六边形晶格(lattice),由主要衣壳蛋白p72的    8 280个拷贝(以三聚体排列)和位于顶端的五联体蛋白(penton protein)的60个拷贝组成。简而言之,细胞外病毒由通过出芽获得的外膜、外衣壳、二十面体膜、二十面体内衣壳以及封闭的核壳和类核组成,该病毒结构示意图如图1所示。

最近,ASFV复杂的衣壳结构被进一步解开,显示主要的衣壳蛋白(p72蛋白)和四个稳定的次要蛋白(H240R蛋白、M1249L蛋白、p17蛋白、p49蛋白)以五边形和三边形对称体的方式相互作用。在p72蛋白的形成过程中,需要B602L蛋白作为伴侣蛋白。

ASFV基因组由一个170~190 kb的双链DNA分子组成,包含151~167个开放阅读框(open reading frames,ORFs),ORFs的数量取决于ASFV的毒株。ASFV基因组的两端由末端反向重复序列(inverted terminal repeats)和发夹环(hairpin loops)组成。ASFV基因组编码了许多参与病毒组装、DNA复制和修复的蛋白质;还编码参与免疫调节的蛋白质,如干扰I型干扰素和细胞死亡途径的蛋白质。大约一半的ASFV基因仍无任何已知或可预测的功能。

直到最近,根据二维分析结果,已知ASFV拥有54种结构蛋白。如上所述,ASFV外膜是通过出芽方式从宿主细胞中获得的,病毒附着蛋白p12似乎定位于外膜。另一个值得关注的外膜蛋白是EP402R基因产物CD2v蛋白。它与T淋巴细胞表面黏附受体CD2具有序列同源性。这种蛋白是血细胞吸附现象所必需的,可能对病毒的致病机制极为重要,对病毒在节肢动物体内的复制也很重要。它还与适配蛋白1(adaptor protein 1,AP-1)相互作用,并可能参与细胞通路重塑(cellular traffice remodeling)。ASFV弱毒株通常为CD2v蛋白截短。外膜中的另一个蛋白为名叫p24蛋白的细胞蛋白。该衣壳的主要成分是p72蛋白,还含有pB438L蛋白(p49蛋白)、pE120R蛋白(p17蛋白)、H240R蛋白和M1249L蛋白等。其内膜似乎来自于内质网,包含膜蛋白p54、p17、p12(在外膜中也被发现)和pE248R蛋白。所谓的核心壳,现在被定义为内衣壳,由pp220蛋白和pp62蛋白以及pS273R蛋白组成。后者是一种处理病毒多聚蛋白的酶。順序切割生成p150蛋白、p37蛋白、p34蛋白、p14蛋白、p35蛋白和p15蛋白。如上所述,p15蛋白可能是该内衣壳的主要衣壳蛋白。该核心壳中的核蛋白是p10蛋白和pA104R蛋白(组蛋白样蛋白),核心应该包含转录机制。

最近,蛋白质组学工具的使用使人们能够更好地掌握病毒蛋白和病毒宿主之间的相互作用。沿着这些思路,Alejo等利用质谱和免疫电镜对检测到的蛋白质进行定位,建立了一个更新的ASFV粒子与vero细胞适应株“BA71V”的图谱。该方案总共确定了68种病毒蛋白,其中包括所有以前已知的结构蛋白(见上文)和44种迄今未被识别的蛋白。有趣的是,23种蛋白质与病毒的某些功能无法关联起来,但这些蛋白质却是病毒体的重要组成部分。

Kessler等在另一项研究中利用ASFV低致死毒株OURT88/3株的重组衍生物研究ASFV在易感(野猪)和非易感宿主(人、猴)的哺乳动物细胞系中的基因表达。在ASFV OURT88/3株的157个ORFs中,94个被鉴定为蛋白质。有趣的是,一些最丰富的蛋白质也未被定性,其中包括pK145R蛋白和pI73R蛋白,它们是今后需要研究的候选蛋白。Karger等总结并比较了上述两项研究。可以看出,对于大多数预测的ORFs来说,可以证明蛋白质的存在。然而,对于其他的ORFs来说,例如多基因家族的成员,仍然缺乏表达的证据。这些ORFs可能只在被感染的宿主或其主要靶细胞中发挥作用。这也可以解释为什么这些基因在ASFV的细胞培养适应株中经常被剔除。

上述研究是利用永久细胞系而非ASFV主要靶细胞进行的,这可能会对研究结果产生重大影响。到目前为止,很难产生一个又大又纯的受感染的巨噬细胞群。不过,相关研究机构正在探讨分类、同步和改进的方案,以备将来研究使用。

ASFV主要在单核吞噬系统的细胞中复制,并且通过网格蛋白介导和缢断蛋白(dynamin)依赖的内吞作用和巨胞饮作用进行。研究表明,肌动蛋白依赖性的内吞作用和涉及微管活性的内吞通量也与此有关,即经典吞噬作用。其细胞受体及其病毒配体尚不清楚,一个假定的CD163受体仍存在争议,但CD163基因敲除的猪对ASFV仍然易感。Lithgow等在与猪骨髓黏附细胞易感性相关的表面标记中发现了CD45受体。

ASFV进入细胞内后,要解开病毒的衣壳需要启动整个内肢体途径(endosomal pathway),衣壳在内体腔的酸性环境中分解。在pE248R蛋白介导下衣壳和融合膜降解,病毒核心被释放到细胞质中。病毒DNA的释放需要泛素-蛋白酶体系统的作用。病毒的复制和组装在靠近细胞核的特殊病毒工厂中进行,新形成的病毒通过出芽从感染的细胞中释放出来。至于强烈调控转录和RNA加工,则需要病毒编码的酶。Almazan等指出,可以区分即时的、早期的、中期的和晚期的RNA转录物。虽然病毒复制的主要阶段在细胞质中进行,但Rojo等指出早期的成核阶段也发生在细胞质中,此阶段牵涉核纤层网络(lamina network)的解体和核蛋白的重新分布。最近,Sim?es等详细回顾了成核阶段的作用,并对目前掌握的信息进行了汇编。可以证明,ASFV感染激活了DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)途径,改变了细胞核形态(nuclear landscape)和细胞表观遗传特征,促进了有效感染和后代的形成。例如,ASFV的有效复制取决于与细胞周期控制、凋亡和免疫反应相关的早幼粒细胞白血病核体的相互作用。此外,异染色质是经诱导形成的,很可能是为了使编码不利于病毒复制的蛋白质的宿主基因保持沉默。这些病毒诱导的重排可能解释了上述的核纤层网络的裂解。综上所述,ASFV破坏了亚核结构域和染色质结构,并诱导核结构改变,以加强压制性核环境,使病毒能在宿主细胞中有效复制。然而,细胞核的全部作用仍不清楚,需要进一步研究。

最近,Galindo和Alonso对ASFV一般复制进行了更详细回顾,Rodríguez和Salas则特意对转录进行了详细综述。

差距和进一步研究的方向:

对ASFV毒力基因、宿主范围和病毒-载体-宿主的相互作用知之甚少。需要大量ASFV基因型高质量的全长基因组序列,以便能够对病毒有更深入的了解。

在ASFV的150~170个ORFs中,大多数只是预测,很少有RNA水平或蛋白质水平上的实验性证据。因此,需要进一步研究以更好地了解病毒蛋白及其在不同条件下的表达。

还需要了解宿主方面的反应,特别是病毒受体、先天性免疫反应以及病毒与宿主在细胞水平上的互作。

应加快对ASFV蛋白质功能的研究。

1.2 ASFV活力的稳定性和灭活

ASFV在环境和生猪肉制品中高度稳定,低温、潮湿和富含蛋白质的环境有利于其存活。因此,ASFV在冷藏猪肉中的感染期可长达  15周,在腌制的火腿中可长达6个月,在帕尔玛火腿中可达399 d。在液态猪粪中,ASFV能够稳定存活100 d以上;在猪的液态血液中,室温下ASFV可存活18个月,在4 ℃下最多存活6年。欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)在《非洲猪瘟科学报告》中给出了详细的清单。最近和正在进行的研究探讨了与ASFV间接传播有关的材料,如饲料、食物、土壤和尸体。对于饲料原料,Stoian等的研究重点是跨洋运输时ASFV的稳定性。在这些条件下计算出的ASFV的半衰期从9.6 d到14.2 d不等,具体时间取决于ASFV所处的基质。此外,Niederwerder等研究发现,ASFV可以通过被污染的液体和干饲料传播。在考察这些研究的结果时,病毒的载量和拷贝数是重要的影响因素,因此需要进行更多的研究。在一项关于ASFV在受污染作物中活力稳定性的实验室规模的研究中,研究人员探讨了干燥和热灭活对病毒活性的影响。总之,ASFV在干燥的室温环境中经过2 h被灭活。关于ASFV在猪胴体中的稳定性,最近立陶宛的研究人员进行了一项研究。Zani等将于不同时间掩埋在不同地点的感染了ASFV的野猪尸体挖掘出,随后利用体外检测法检测传染性ASFV,用qPCR法测定病毒的基因组。出乎意料的是,从尸体中只检测出病毒基因组,而所有的病毒分离尝试结果均为阴性。Carlson等在最近一项尚未发表的研究中探讨了土壤对ASFV活性的影响。简言之,在不同的土壤基质中掺入感染野猪的ASFV阳性血液,随后检测病毒的活性。土壤pH、结构和环境温度对ASFV活力的稳定性起着重要的作用。对于沙地或花园类的土壤,几周后仍可分离到活病毒;对于沼泽地的土壤,几天后可分离到病毒;未能从森林的酸性土壤中分离出病毒。用柠檬酸或氢氧化钙缓解土壤的酸碱性,结果显示ASFV在所有类型的土壤中均完全失活。

研究人员提出的另一个问题是ASFV在以猪粪便为原料的沼气厂废弃物中的灭活情况。Davies等调查了ASFV在实验性感染猪的粪便和尿液中的存活时间。根据计算出的半衰期可以认为,在37 ℃下,ASFV经过约4 d(尿液)或3 d(粪便)后仍具有传染力。在沼气厂的沼气生产环境中,应考虑如pH和代谢物等次要因素,因此上述这些时间可以下调。Turner和William的研究表明,在40 ℃下,猪粪中ASFV经4 h即可灭活。Moss得出的结论是,如果沼气厂采用正确的生产工艺,数小时(采用高温生产工艺的沼气厂)或数天(采用中温生产工艺的沼气厂)可使ASFV灭活。然而,必须考虑到(与高度安全的實验室或现代熬炼厂相比),这些工厂在设计生产工艺时通常没有考虑严格的黑/白分离。在工厂中,例如紧随其后的是化肥厂,可以认为再次污染的情况也将不会发生,因为在真空生产环境中发酵基质的数量会逐步减少。

世界各地都在使用不同种类的消毒剂。在实验条件下,过氧乙酸或甲酸消毒剂显示出良好的杀病毒效果。一般来说,ASFV对脂类溶剂、洗涤剂以及氧化剂敏感。EFSA发表了一份科学报告,介绍了在田间条件下(与氢氧化钠和碳酸钠相比)被授权消毒剂功效的最新数据。原则上可以认为,对其他包膜DNA病毒显示出良好灭活功效的消毒剂对ASFV也有效。

差距和进一步研究的方向:

饲料、饮水和垫料对ASFV传播的作用仍有争议,需要进一步研究。

病死猪掩埋地是否需要采用消毒措施仍然是一个没有定论的问题,需进一步测试ASFV的稳定性,如使用不同种类的土壤,对改进风险评估是必要的。

虽然抗包膜病毒的消毒剂在标准化条件下能够有效杀灭ASFV,但需要找到切实有效的方法,以在资源有限的环境和表面结构复杂的物体(如木质物资、开放性混凝土或其他种类的地板)上测试消毒剂的有效性,并选择合适的针对ASFV的消毒剂。

1.3 遗传多样性和分型

在过去几十年里,研究人员利用不同的遗传区域,通过测定小DNA片段中部分基因序列对ASFV分离株进行定型。用于基因型命名的区域通常是p72编码区,对p54、p72和pB602L基因进行测序,可以获得更好的鉴别能力。基于这一思路,Boshoff等已经在非洲鉴定出24种ASFV基因型。遗传多样性通过森林循环得到提高,但这些地区之外并不存在这种情况。此外,病毒的基因型与其毒力或致病性没有关系。“国际”基因型是Ⅰ型和Ⅱ型。

总体而言,ASFV非常稳定,基因突变率非常低。这导致该病毒在发病地区的遗传变异性很低,即使使用下一代测序技术,通常也不能以更高的分辨率对病毒毒株进行分子追踪,例如在发生疫情时的分子流行病学。只有全基因组才可能有所区别,并可推断出毒力因子。同样,通过全基因组测序也能更好地识别新毒株的基因缺失变种。在过去的十年中,一些科学实验计划已得到了优化,包括长片段牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore MinION)测序 技术。

在目前的流行状态下,ASFV每天都会产生新的基因序列,控制检测质量是最重要的。否则,测序的错误率可能高于病毒复制过程中的错误率,而测序错误会被误解和过度解读为重大差异。最近,为获得可靠和高质量的全基因组序列,已经建立了一个深度测序流程(deep-sequencing workflow)。这个工作流程基于靶向富集和使用不同测序平台来规避特定的缺点。国际合作是为未来研究提供可靠数据的关键。

差距和进一步研究方向:

必须努力优化和协调样本选择、基因测序、生物信息学工作流程和数据文档的协议,最有效地利用财政和技术资源。

在一个有针对性的方法中,应该生成所有可用基因型和宿主物种的全基因组序列,作为进一步研究的基础。

应加快发现与非洲猪瘟病毒科有关的病毒,以便进行进化分析。

原题名:African swine fever – A review of current knowledge(英文)

原作者:Sandra Blome、Kati Franzke和Martin Beer

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