支气管哮喘患儿基质金属蛋白酶-16、自噬相关基因5和自噬相关基因7的表达及其与肺功能的相关性

许花芬, 冯 琼, 李春蕾

(海南省人民医院 新生儿科, 海南 海口, 570311)

支气管哮喘(简称哮喘)是儿童时期常见的慢性呼吸系统疾病，其主要病理特点为慢性气道炎症、气道重塑、气道高反应性等[1]。哮喘严重威胁患儿生活质量及心理健康，给家庭及社会带来沉重负担[2]。相关研究[3]显示，微小RNA-30a(miRNA-30a)靶向自噬相关基因5(ATG5), 并通过抑制自噬减轻哮喘患者气道纤维化。LOU L L等[4]研究表明, miRNA-192-5p通过靶向基质金属蛋白酶-16(MMP-16)和自噬相关基因7(ATG7)减轻哮喘患者气道重塑，推测MMP-16、ATG5、ATG7可能在哮喘的发生发展中发挥重要作用。目前，有关MMP-16、ATG5、ATG7与哮喘病情程度及肺功能相关性的研究仍较少。本研究分析哮喘患儿外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA与肺功能的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2020年1月—2021年3月住院的哮喘患儿80例作为观察组，男42例，女38例，年龄4～13岁，平均(7.02±2.16)岁; 将急性发作期患儿根据病情程度分为轻度组46例和中重度组34例。选取同期本院体检儿童80例作为对照组，男43例，女37例，年龄5～13岁，平均(7.14±2.09)岁。纳入标准: ① 符合儿童支气管哮喘的诊断标准者[5]; ② 患儿无严重哭闹现象，依从性良好，可配合完成本研究; ③ 患儿临床资料齐全，对照组无近期感染疾病史、变态反应性疾病史以及家族过敏性疾病，哮喘患儿均为新发或停止规范吸入糖皮质激素超过3个月的复发哮喘; ④ 儿童监护人自愿参加本研究，同时签署知情同意书，本研究获本院临床伦理委员会审核通过。排除标准: ① 伴有先天性代谢性疾病、免疫系统疾病及感染性疾病者; ② 过敏性哮喘或因支气管、肺发育不良等疾病而引起喘息、咳嗽、气促者; ③ 伴有重要脏器功能障碍或恶性肿瘤者。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒(货号R1200-100)购自北京索莱宝科技有限公司; 反转录试剂盒(货号RE0510-100T)购自定州百克赛斯生物科技有限公司; SYBR Green Master Mix(货号BYGL-GK10002)购自南京北鱼生物科技有限公司; 肺功能检测仪(型号HI-801)购自日本捷斯特公司; 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪(型号CFX96)购自美国Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存: 抽取各组(观察组患儿分别于急性发作期和临床缓解期各采集1次血样)空腹外周静脉血样置于离心管中，并加入同等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)充分混匀，稀释后将其缓慢、贴壁加入盛有外周血淋巴细胞分离液的离心管中，切忌破坏界面。将样品放入离心机中, 3 000转/min离心15 min后可见离心管中出现明显分层。收集乳白色外周血单个核细胞层到EP管, 2 000转/min低温离心5 min。弃上清，收集乳白色细胞后加入5倍体积的PBS, 1 000转/min低温离心10 min, 弃上清，重复2～3次, -80 ℃保存备用。

1.3.2 外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平检测: 采用qRT-PCR法检测外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平。采用RNA提取试剂盒提取外周血单个核细胞总RNA，测定纯度及浓度后采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用Genbank获得基因号，引物设计软件设计引物后委托上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系: cDNA(50 ng/μL)5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各2 μL, SYBR Green Master Mix 25 μL, ddH2O 16 μL。各样品设3个重复，采用2-△△CT法计算外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA相对表达量,GAPDH为内参基因，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 肺功能指标检测: 采用肺功能检测仪检测各组(观察组患儿分别于急性发作期和临床缓解期各检测1次)儿童肺功能指标，包括第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%)、用力肺活量(FVC)、最大呼气峰流速占预计值百分比(PEF%), 计算第1秒用力呼气容积占用力肺活量的比率(FEV1/FVC), 操作步骤均严格按照仪器使用说明书进行。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 观察组与对照组外周血单个核细胞

MMP-16mRNA、ATG5mRNA和

ATG7mRNA水平比较

观察组急性发作期和临床缓解期外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组组内比较发现，急性发作期外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平高于临床缓解期，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 观察组与对照组外周血单个核细胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA和ATG7 mRNA水平比较

2.2 观察组与对照组肺功能指标比较

观察组急性发作期和临床缓解期FEV1%、FEV1/FVC和PEF%低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 观察组组内比较发现，急性发作期FEV1%、FEV1/FVC和PEF%低于临床缓解期，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 观察组与对照组肺功能指标比较 %

2.3 急性发作期哮喘患儿外周血单个核细胞

MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA

与肺功能指标的相关性

Pearson分析结果显示，急性发作期哮喘患儿外周血单个核细胞MMP-16mRNA与ATG5mRNA、MMP-16mRNA与ATG7mRNA、ATG5mRNA与ATG7mRNA均呈显著正相关(r=0.536、0.542、0.534,P<0.05)，且MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA与FEV1%、FEV1/FVC、PEF%均呈显著负相关(P<0.05)。见图1、表4。

A: MMP-16 mRNA与ATG5 mRNA的相关性; B: MMP-16 mRNA与ATG7 mRNA的相关性; C: ATG5 mRNA与ATG7 mRNA的相关性。图1 急性发作期哮喘患儿外周血单个核细胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA的相关性

表4 急性发作期哮喘患儿外周血单个核细胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA与肺功能指标的相关性

2.4 轻度组与中重度组外周血单个核细胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA及肺功能指标比较

与轻度组比较，中重度组外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平较高, FEV1%、FEV1/FVC、PEF%较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 轻度组与中重度组外周血单个核细胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA及肺功能指标比较

3 讨 论

哮喘是一种气道上皮下基底膜增厚、水肿、黏液高分泌、气道平滑肌收缩的可逆性肺部疾病[6]。多种细胞及组分参与的炎性反应、气道结构重塑和气道上皮细胞损伤在哮喘发病中起重要作用[7-8]。哮喘发病机制较为复杂，任何单一途径的治疗手段都可能有局限性[9]。

MMP-16是一种分泌型基质金属蛋白酶的活化剂，其细胞外活性主要受组织金属酶抑制因子的控制，可作为预测癌症化疗敏感性的生物标志物[10]。MMP-16与细胞增殖、迁移、侵袭有关[11]。本研究中，哮喘患儿外周血单个核细胞MMP-16mRNA水平显著升高，且随着急性发作期哮喘患儿病情由轻度发展为中重度，外周血单个核细胞MMP-16mRNA水平呈现升高趋势，结合LOU L L等[4]研究结论，推测MMP-16mRNA表达水平升高后，可能通过调控气道上皮下基底膜增厚、胶原蛋白沉积而参与气道结构重塑，进而影响哮喘的发生、发展。DUANX J等[12]研究结果表明, MMP-16与哮喘疾病中的炎症反应有关。推测本研究中MMP-16mRNA的高表达也可能通过调控炎症反应来加速哮喘疾病的发生发展。既往研究[13]证明，炎症性疾病的发生发展可激活自噬，而自噬可反馈调节炎症因子的表达及分泌，最终影响炎症性疾病的预后及转归。

随着对哮喘发病机制的不断深入研究，学者[14]发现作为细胞死亡程序的自噬在哮喘疾病的发生发展中有重要作用。ATG与自噬密切相关，且在慢性阻塞性肺疾病的发生发展中起着重要作用[15]。目前研究较为广泛的ATG包括ATG5、ATG7、ATG6等，其中ATG5、ATG7对自噬的发生起决定性作用[16]。本研究中，哮喘患儿外周血单个核细胞ATG5mRNA、ATG7mRNA水平显著升高，且其水平随着急性发作期哮喘患儿病情加重而进一步升高，结合LIB B等[3]研究结论，推测病理状态下ATG5mRNA、ATG7mRNA表达水平上升，自噬水平上升，自噬降解蛋白质产生的氨基酸为胶原蛋白沉积提供能量和合成原料，进一步加重气道纤维化和气道重塑，加速哮喘病情进展。

本研究结果还表明，急性发作期哮喘患儿MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平与肺功能指标FEV1%、FEV1/FVC、PEF%均存在相关性，且随着治疗后临床缓解期患儿肺功能的改善，MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平也随之下降，此结果提示各指标变化对评估哮喘治疗效果有重要作用，临床中可通过检测各指标水平变化，评估哮喘肺功能改善程度及治疗效果，为制订更有效的治疗方法提供参考。本研究中，急性发作期哮喘患儿外周血单个核细胞中MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA均呈显著正相关。胡红霞等[17]研究结果显示，ATG5可通过调节MMP-9影响细胞增殖和侵袭，推测MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA在哮喘的发病中可能同样存在调控机制，其中ATG5mRNA、ATG7mRNA可能通过调控MMP-16mRNA的表达水平而参与哮喘的发生发展，其具体作用机制仍待进一步研究验证。

综上所述，哮喘患儿外周血单个核细胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平升高，且均与肺功能指标FEV1%、FEV1/FVC、PEF%呈显著相关性。MMP-16、ATG5、ATG7可能作为新的治疗靶点用于哮喘急性发作期的治疗，为新靶点的进一步探究提供了思路。