功能基因组学方法筛选蟾毒灵抗肝癌细胞的潜在凋亡靶点

林家茂 张晨月 部帅 李振祥 赵成龙 王海永

摘要 目的：筛选中药单体蟾毒灵促进人肝癌细胞凋亡的潜在分子靶点。方法：以人肝癌细胞株PLC/PRF/5为体外模型，观察中药单体蟾毒灵对人肝癌细胞凋亡以及相关基因表达的影响。以不同浓度的蟾毒灵分别作用于PLC/PRF/5细胞24 h、48 h、72 h，检测其对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。通过高通量Illumina RNA测序，筛选蟾毒灵作用人肝癌细胞后基因表达的变化，并进行生物信息学分析。结果：中药单体蟾毒灵可抑制人肝癌细胞增殖并诱导其凋亡;中药单体蟾毒灵可诱导不同基因的表达;基因本体（GO）富集分析表明，中药单体蟾毒灵可以影响细胞周期、凋亡等通路的变化;京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析凋亡通路表明，钙离子诱导的细胞死亡途径中的钙蛋白酶表达明显上调。结论：中药单体蟾毒灵具有明显的抗肝癌细胞凋亡作用，并可通过作用相关信号通路中的多靶点参与此过程。

关键词 蟾毒灵;肝癌;增殖;凋亡;转录组学;体外;基因表达;生物信息学

Screening of Potential Targets of Bufalin against Hepatocellular Carcinoma Cells by Functional Genomics

LIN Jiamao1，ZHANG Chenyue2，BU Shuai3，LI Zhenxiang1，ZHAO Chenglong1，WANG Haiyong1

（1 Shandong Cancer Hospital and Institute，Ji′nan 250117，China; 2 Fudan University Shanghai Cancer Center，Shanghai 200032，China; 3 The Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250001，China）

Abstract Objective：This study aims to screen molecular targets of bufalin in promoting apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells.Methods：The effect of bufalin on apoptosis and gene expression of human hepatocellular carcinoma PLC/PRF/5 cells was investigated.To be specific，the PLC/PRF/5 cells were treated with different concentration of bufalin for 24 h，48 h，and 72 h，respectively，and the proliferation and apoptosis of the cells were detected.Illumina high-throughput sequencing of RNA was performed to observe the changes of gene expression in the cells treated with bufalin，and the bioinformation of related genes was analyzed.Results：Bufalin inhibited the proliferation and induced the apoptosis of PLC/PRF/5 cells.It induced the expression of different genes.Gene Ontology（GO） term analysis showed that bufalin influenced cell cycle，apoptosis，and other pathways.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway analysis suggested that calpain was significantly up-regulated in calcium-induced cell death pathway.Conclusion：Bufalin remarkably promotes the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells through multiple targets in related pathways.

Keywords Bufalin; Hepatocellular carcinoma; Proliferation; Apoptosis; Transcriptome; In vitro; Gene expression; Bioinformatics

中图分类号：R273;R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.002

目前普遍认为肿瘤的发生发展是多因素所致的病理过程[1-2]。基因改变是肿瘤发生发展的重要原因[3-4]。目前临床中所用的许多化疗药物就是针对基因突变的分子而发挥良好的抗肿瘤功效[5-6]。

蟾毒灵是从中药蟾酥中提取的最具活性的抗肿瘤成分，已被证实对多种肿瘤具有很强的抗肿瘤作用[7-9]。研究表明，蟾毒灵可以抑制腫瘤细胞的增殖和迁移，诱导细胞凋亡和逆转耐药性[10-14]。然而，目前并没有对蟾毒灵作用肝癌细胞后基因的变化进行全面筛选的相关报道。因此，本研究主要筛选并分析蟾毒灵对人肝癌细胞作用的潜在分子靶点。本研究使用Illumina RNA测序技术来检测不同浓度蟾毒灵作用人肝癌细胞后相关基因差异表达情况，并进行相关生物信息学分析。6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 细胞 PLC/PRF/5细胞（中国科学院细胞库）。

1.1.2 药物 蟾毒灵（Sigma公司，美国，批号：B0261）。

1.1.3 试剂与仪器 胎牛血清（Hyclone公司，美国，批号：SH30084），青霉素/链霉素（Procell公司，批号：PB180120），二甲基亚砜（Sigma公司，美国，批号：D2650），胰酶（Gibco公司，美国，批号：25200-072），磷酸盐缓冲液（Hyclone公司，美国，批号SH30256.01B），高糖DMEM培养基（Hyclone公司，美国，型号：SH30022.01B），细胞计数CCK8试剂盒（Dojindo分子技术公司，日本，SKU：CK04），流式细胞仪（Beckman Counter，美国，型号：FC500），Annexin V-7AAD细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司，批号：C1062）。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖 细胞培养基由高糖DMEM培养基添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素配制而成，放置于37 ℃含5%二氧化碳的培养箱中培养。细胞达到80%融合后传代。溶于二甲基亚砜，稀释至工作浓度（5 nmol/L，20 nmol/L）。用细胞计数CCK8试剂盒测定细胞增殖。将PLC/PRF/5细胞按5 000细胞/孔密度接种于96孔板中。在37 ℃条件下，用5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L蟾毒灵分别处理细胞24 h、48 h、72 h，然后用CCK-8比色法测定细胞成活率。用微量平板阅读器在460 nm处测量吸光度，以确定细胞成活率。细胞增殖实验重复3次。

1.2.2 細胞周期分析 将PLC/PRF/5细胞接种于6个孔板中，每孔接种2×105个细胞，在37 ℃下用5 nmol/L或20 nmol/L蟾毒灵孵育24 h，用0.25%胰酶消化细胞，然后用磷酸盐缓冲液洗涤。进行细胞周期分析[碧云天生物技术研究所，细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（C1052）]。随后，细胞在4 ℃的70%甲醇中固定2 h，并用碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）[生工生物工程（上海）股份有限公司，E607306PI 染色试剂盒]染色，PI由0.5 mL染色缓冲液，25 μL的PI染色试剂（20×），10 μL的Rase A（50×）在37 ℃下染色30 min。使用流式细胞仪检测激发波长为350 nm的荧光，多周期AVDNA分析软件（Version306;Phoenix Flow Systems，美国）。

1.2.3 细胞凋亡分析 将处于对数生长期的PLC/PRF/5细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，分别加入5 nmol/L和20 nmol/L浓度的蟾毒灵。以未经处理的人肝癌细胞作为对照。处理72 h后，收集细胞，离心（1 000×g），用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液以2 000 r/min冷洗5 min，然后悬浮在100 μL 1×结合缓冲液中。接下来，将细胞与5 μL Annexin V和5 μL 7-AAD在25 ℃避光孵育15 min。最后，每个样本注入400 μL的1倍结合缓冲液，进行Annexin V-7AAD细胞凋亡检测试剂盒检测。然后用Cell Quest软件评估细胞凋亡。实验重复3次。采用Annexin V/7AAD法检测蟾毒灵处理的PLC/PRF/5细胞的凋亡率。用5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒灵处理PLC/PRF/5细胞，检测细胞凋亡率。

1.2.4 Illumina HiSeq测序 按照Illumina TruseqTM RNA样品制备试剂盒，使用5 μg总RNA制备转录组文库;运用磁珠法使用Epicentre Ribo-zeroTM rRNA Removal Kit（Epicentre，美国）分离mRNA后，用乙醇沉淀法清洗rRNA残留物。其次通过TruseqTM RNA sample prep Kit进行双链cDNA合成、补平、3′端加A、连接Index接头;通过TBS380 Picogreen进行文库富集，PCR扩增15个周期;使用Bio-Rad 2%琼脂糖胶回收目的条带（Certified Low Range Ultra Agarose）;TBS380（Picogreen）定量，按数据比例混合上机后，使用cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS上进行桥式PCR扩增，生成clusters;最后在Illumina Hise4000测序平台，进行2×150 bp测序。

1.2.5 差异表达与功能富集分析 基于fpkm的计算公式使用Cuffdiff（http：//cufflinks.cbcb.umd.edu/）软件，计算每2个样品之间的表达差异，2个样品之间的差异表达基因（Differentially Expressed Gene，DEG）选择标准为：使用差异倍数对数大于2且假发现率（False Discover Rate，FDR）小于0.05。我们通过利用Gotools（https：//github.com/tanghaibao/Goatools）和Kobas（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以明确DEG的功能。通常情况下，经过Bonferroni校正的DEG的P值<0.05时，认为此GO功能和代谢通路存在显著富集情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，以均数±标准差（±s）表示来自3个独立实验的数据。使用方差分析，然后使用非配对t检验进行组后配对比较，以分析3个以上组之间的差异。所有统计检验均为双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F

2 结果

2.1 中药单体蟾毒灵抑制人肝癌细胞增殖的作用呈浓度和时间依赖性

5 nmol/L蟾毒灵对PLC/PRF/5细胞增殖有明显的抑制作用。随着浓度的升高蟾毒灵抑制PLC/PRF/5细胞增殖作用更为明显。80 nmol/L蟾毒灵孵育肝癌细胞72 h后，PLC/PRF/5细胞增殖能力最弱，总体而言，随着蟾毒灵浓度增加，PLC/PRF/5细胞成活率呈现逐渐下降的趋势。见图1。蟾毒灵抑制人肝癌细胞增殖具有时间和浓度依赖性。

2.2 蟾毒灵诱导人肝癌细胞的凋亡

细胞周期分析显示，5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒灵处理的人PLC/PRF/5肝癌细胞均被阻滞于G1期，经蟾毒灵刺激后的人肝癌PLC/PRF/5细胞中G1期细胞比例略高于对照组。见图2A。与未处理的细胞比较，5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒灵作用后的肝癌细胞的凋亡率均升高。经5 nmol/L蟾毒灵处理后的人肝癌PLC/PRF/5细胞凋亡率为5.9%，而20 nmol/L蟾毒灵孵育的人肝癌PLC/PRF/5细胞凋亡率为11.8%。与对照组比较，较低浓度（5 nmol/L）和较高浓度（20 nmol/L）蟾毒灵处理的人肝癌细胞均出现明显的凋亡。见图2B。

2.3 蟾毒灵对PLC/PRF/5细胞基因表达的影响

结果表明，与未处理的细胞比较，低浓度蟾毒灵（5 nmol/L）、高浓度蟾毒灵（20 nmol/L）作用于肝癌细胞后，都可见基因表达的差异。在蟾毒灵处理的PLC/PRF/5细胞中，发现一系列基因表达上调和下调。总共有168个基因在5 nmol/L蟾毒灵处理的PLC/PRF/5细胞和未处理的PLC/PRF/5细胞之间发生了显著的基因表达变化。此外，在20 nmol/L蟾毒灵处理的PLC/PRF/5细胞中，136个基因的表达与未处理的细胞比较发生了显著的变化。与未处理的PLC/PRF/5细胞比较，经5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒灵处理的PLC/PRF/5细胞中，有20个基因的表达都发生变化。见图3A。5 nmol/L蟾毒灵处理的细胞与未处理细胞，和5 nmol/L蟾毒灵处理的细胞与20 nmol/L蟾毒灵处理的细胞比较，47个基因的表达发生显著变化。见图3B。此外，比较5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒灵处理的细胞中显著改变的基因发现，338个基因的表达发生变化。20 nmol/L蟾毒灵处理的细胞与未处理细胞，和20 nmol/L蟾毒灵处理的细胞与5 nmol/L蟾毒灵处理的细胞比较，有49个基因的表达发生显著变化。见图3C。此外，未处理的细胞和经5 nmol/L或20 nmol/L蟾毒灵处理的人肝癌细胞表达差异的基因见图3D。这个基因列表与图3A～C中的基因有很大不同。上述结果表明，蟾毒灵可显著改变人肝癌细胞的基因表达。

2.4 蟾毒灵調控基因功能的富集分析

与未经处理的肝癌细胞比较，20 nmol/L蟾毒灵处理的肝癌细胞具有与下列生物学过程相关：“正向调节细胞凋亡过程”“正向调节蛋白质定位于膜”“正向调节细胞骨架组织”。见图4A。另外，5 nmol/L蟾毒灵处理的人肝癌细胞与对照组比较，“细胞周期相变调控”“基因表达转录后调控”和“细胞大分子生物合成过程负调控”相关的信号通路发生了显著改变。见图4B。5 nmol/L与20 nmol/L蟾毒灵处理的肝癌细胞比较，与“有丝分裂细胞周期检查点的信号转导”“细胞酰胺代谢过程的调节”“视觉学习”和“对DNA损伤刺激的反应的调节”相关的通路存在差异。见图4C。

2.5 蟾毒灵促进肝癌细胞凋亡的通路KEGG分析

蟾毒灵可引起多种凋亡相关蛋白以及通路的变化。在所有调控基因中，钙离子诱导的细胞死亡途径中的钙蛋白酶表达明显上调。见图5。

3 讨论

中药单体蟾毒灵是从中药蟾酥中提取的一种有效的抗肿瘤活性物质，它能抑制肿瘤细胞的增殖和迁移、诱导细胞凋亡，并能逆转多药耐药。许多研究报道蟾毒灵抗肿瘤机制[15-18]。近年来，人们采用基因组水平的方法来研究抗肿瘤药物的分子机制，如高通量测序方法、基于质谱技术的蛋白质组学策略和数据分析方法。为了实现对蟾毒灵潜在靶点的全面分析，我们采用了高通量下一代测序技术。既确定了蟾毒灵的潜在靶点，又发现了蟾毒灵可能调控的分子通路。这些初步结果为进一步研究蟾毒灵的分子机制奠定了基础。

癌变是一个受基因改变调控的过程[19-21]。基因表达的任何变化都会影响个体的生理功能。在目前的研究中，我们检测了蟾毒灵作用人肝癌细胞后的基因。分析蟾毒灵处理细胞中的这些基因改变具有重要的价值。不可否认，蟾毒灵也可诱导某些癌基因表达，抑制某些抑癌基因的表达。造成这种现象的原因有以下几个方面：第一，蟾毒灵的作用在很大程度上依赖于其浓度。肝癌细胞的增殖和凋亡取决于蟾毒灵作用的浓度。其次，没有一种药物可以上调所有的抑癌基因，也不能下调所有的癌基因。蟾毒灵的抗肿瘤作用是其对癌基因和抑癌基因作用的综合整合结果。本研究检测到蟾毒灵的几个潜在靶点，可能为蟾酥等中药治疗肝癌的个体化治疗提供基础。根据本研究的数据，这些潜在的基因可能是有效的作用靶点，受影响的途径也可能是潜在的干预途径。

综上所述，采用Illumina RNA测序的方法对蟾毒灵潜在的分子机制进行了分析。获得了对其靶点的概述和全面的视角，这将为蟾毒灵在抗肝癌进展中的作用提供更好的视角和见解。

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（2021-03-11收稿 本文编辑：吴珊）

基金项目：山东省重点研发计划项目（2018GSF119014）;山东省泰山学者基金资助项目（tsqn201812149）;山东第一医科大学学术提升计划项目（2019RC004）作者简介：林家茂（1985.10—），男，博士，主治医师，研究方向：中医药抗肿瘤，E-mail：linjiamao_@126.com通信作者：王海永（1983.12—），男，博士，副主任医师，研究方向：中医药抗肿瘤，E-mail：wanghaiyong6688@126.com6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F