银翘散配方颗粒的HPLC特征图谱研究

农新维,王 婵,黄雄梅,韦红言,王熙珍

培力(南宁)药业有限公司,南宁 530007

银翘散出自《温病条辨》,此方由金银花、连翘、荆芥、淡豆豉、薄荷、淡竹叶、牛蒡子、桔梗、甘草和芦根10味中药组成,具有疏散风热、清热解毒的功效[1],用于外感风寒、发热头痛、口干咳嗽、咽喉疼痛、小便短赤等的治疗[2]。现代临床上主要将其用于流感、肺炎等疾病的治疗,也普遍用于内科、耳鼻喉科、外科、眼科、儿科、感染科及皮肤科多种疾病的治疗[3-7]。银翘散配方颗粒是以银翘散为基础,采用现代工艺进行水提取、浓缩、干燥、制粒而成的复方颗粒剂。目前关于银翘散整体评价的研究主要集中在中药散剂、煎液的指纹图谱及多指标含量测定等方面[8-20],尚无采用特征图谱控制银翘散配方颗粒质量的报道。本研究采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)构建银翘散配方颗粒特征图谱,对共有特征峰进行来源归属与化学成分指认,明确了银翘散配方颗粒的主要化学成分组成;通过对银翘散合煎配方颗粒、单煎配方颗粒及散剂之间的相关性进行研究,探索三者在化学成分方面的差异性;用特征图谱对银翘散配方颗粒进行整体质量评价研究,为银翘散配方颗粒的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱系统(美国安捷伦科技有限公司);XPE205DR型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

绿原酸(批号110753-201314,质量分数96.6%),咖啡酸(批号110885-200102,质量分数99.1%),连翘酯苷A(批号111810-201707,质量分数97.2%),连翘酯苷B(批号111811-201603,质量分数96.6%),3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(批号111782-201204,质量分数94.2%),4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸(批号111894-201706,质量分数97.3%),连翘苷(批号110821-201213,质量分数95.3%),牛蒡苷(批号110819-201309,质量分数95.7%),甘草酸铵(批号110731-201720,质量分数97.7%),均购自中国食品药品检定研究院;新绿原酸(批号MUST-13013001,质量分数>98.0%),隐绿原酸(批号MUST-14041410,质量分数>98.0%),均购自成都曼思特生物科技有限公司;连翘酯苷I(批号21022509,质量分数>98.0%),连翘酯苷H(批号21022507,质量分数>98.0%),均购自成都格利普生物科技有限公司;银翘散配方颗粒及单味配方颗粒均由培力(南宁)药业有限公司提供;乙腈(色谱纯,默克股份两合公司);乙醇(分析纯,广东光华科技股份有限公司);磷酸(分析纯,重庆川东化工有限公司);水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

仪器:Agilent 1260型高效液相色谱系统。色谱柱:Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相:乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脱:0～8 min,5%A;8～14 min,5%A→10%A;14～30 min,10%A→14%A;30～55 min,14%A→16%A;55～65 min,16%A→24%A;65～80 min,24%A→28%A;80～100 min,28%A→80%A)。流速:1.0 mL·min-1。柱温:25 ℃。检测波长:230 nm。进样量:10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷I、连翘酯苷H、连翘酯苷A、连翘酯苷B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草酸铵对照品适量,加甲醇分别制成质量浓度为39.01、45.21、42.09、22.63、50.18、47.60、42.09、58.66、44.52、31.01、17.56、23.60、48.54 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品适量,研细,称取粉末约0.5 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入体积分数为50%的乙醇溶液25 mL,密塞,称定质量,超声处理30 min,放冷,再称定质量,用体积分数为50%的乙醇溶液补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。

2.3 方法学验证

2.3.1重复性实验 取同一批次的银翘散配方颗粒,按2.2.2项下方法制备6份供试品溶液,按2.1项下色谱条件测定。以13号峰为S峰,计算各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。计算得各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于0.73%和2.82%,表明该方法重复性较好。

2.3.2精密度实验 取2.2.2项下制备的同一份供试品溶液,连续进样6次,按2.1项下色谱条件测定。以13号峰为S峰,计算各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。计算得各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于0.38%和1.46%,表明仪器的精密度良好。

2.3.3稳定性实验 取2.2.2项下制备的同一份供试品溶液,分别于0、4、8、12、24、36 h进样,按2.1项下色谱条件测定。以13号峰为S峰,计算各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。计算得各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于0.64%和2.09%,表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.3.4耐用性实验 取同一批次的银翘散配方颗粒,按2.2.2项下方法制备供试品溶液,在2.1项下色谱条件的基础上,采用不同检测柱温(25±5) ℃、流速(1.0±0.1) mL·min-1检测同一份供试品溶液,考察色谱条件的耐用性。以13号峰为S峰,计算各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。计算得各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于2.33%和2.70%,且分离度均良好,表明方法柱温与流速的耐用性良好。

2.3.5银翘散配方颗粒特征图谱的建立 按2.2.2项下方法制备10批银翘散配方颗粒供试品溶液,按2.1项下色谱条件测定特征图谱。结果见图1。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”对该10批银翘散配方颗粒特征图谱进行匹配,生成对照特征图谱。共选择20个重复性良好,响应值较高的色谱峰作为共有特征峰。

注:S1～S10为10批银翘散配方颗粒供试品溶液;1～20号峰为10批银翘散配方颗粒的20个共有峰。

其中13号峰响应值较高,分离良好,保留时间适中,故将13号峰作为S峰,计算各共有特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积,并计算相似度。结果见表1、表2、表3。10批银翘散配方颗粒共有特征峰的相对保留时间较一致,RSD值小于1.30%;共有特征峰相对峰面积的差异较大,RSD值小于27.43%;相似度均大于0.90。

表1 10批银翘散配方颗粒特征图谱的相对保留时间

表2 10批银翘散配方颗粒特征图谱的相对峰面积

表3 10批银翘散配方颗粒特征图谱的相似度

2.3.6特征图谱色谱峰归属与鉴定 取银翘散配方颗粒及各单味配方颗粒,按2.2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进行测定,对银翘散配方颗粒与单味颗粒中各色谱峰保留时间进行比较。结果显示,20个特征峰来源于连翘、金银花等7味药材。另取2.2.1项下混合对照品溶液,按2.1项下色谱条件进行检测,通过与混合对照品色谱图保留时间及紫外光谱进行比较,确认银翘散配方颗粒图谱中13个共有特征峰,根据紫外光谱推断出5个未指认特征峰的化合物类型。结果见图2、图3、表4。

表4 银翘散配方颗粒共有特征峰的来源归属及鉴定结果

注:A.供试品溶液;B.混合对照品溶液;4.新绿原酸;8.绿原酸;9.隐绿原酸;10.咖啡酸;11.连翘酯苷I;12.连翘酯苷H;13.连翘酯苷A;14.连翘酯苷B;15.3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸;16.4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸;17.连翘苷;18.牛蒡苷;20.甘草酸铵;1、2、3、5、6、7、19号峰为10批银翘散配方颗粒的其余7个共有峰。

注:1～20号峰为10批银翘散配方颗粒的20个共有峰。

2.3.7相关性研究 取各单味配方颗粒按银翘散处方配制成银翘散单味配方颗粒混合样品;另取银翘散各味药材,粉碎成细粉,过筛,按处方混匀制成银翘散药材散剂样品。上述样品分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件测定,对比银翘散配方颗粒、单味配方颗粒混合样品及银翘散散剂主要共有特征峰的变化。结果见图4。通过比较特征图谱,发现三者检测出的特征色谱峰数量和相对保留时间基本一致,所含主要化学成分大致相同,银翘散配方颗粒与单味配方颗粒混合样品的相似度为0.951,从化学成分角度分析,合煎制备工艺银翘散配方颗粒与单煎制备工艺配方颗粒混合样品无显著差异。

注:A.银翘散配方颗粒;B.单味配方颗粒混合样品;C.银翘散散剂;1～20号峰为10批银翘散配方颗粒的20个共有峰。

但银翘散散剂的部分特征峰高于银翘散配方颗粒与单味配方颗粒混合样品,说明银翘散散剂与配方颗粒存在较显著的差异。初步分析是由于银翘散散剂为药材粉末,而配方颗粒经过水煎煮,在水煎煮的过程中各特征峰成分的溶出规律存在差异,也存在较复杂成分相互转化机制。

3 讨论

3.1 色谱条件及提取方式筛选

对不同流动相体系、检测波长和供试品溶液的制备方法进行了考察,结果显示,以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液为流动相体系梯度洗脱得到的色谱图基线较平稳且分离效果好;在190～400 nm进行全波长扫描,结果显示,检测波长为230 nm时,特征峰的数量最多且各特征峰响应值较为均衡;用不同体积分数乙醇溶液进行超声提取和回流提取,结果显示,以体积分数为50%的乙醇溶液超声提取30 min得到的色谱图能够最大限度地反映样品的整体特征。

3.2 特征色谱峰的归属

银翘散配方颗粒的20个特征峰来源于连翘、金银花等7味药材,但未发现来源于桔梗、芦根、淡豆豉的显著色谱峰,推测可能因为该3味药材的水提成分含量较低、紫外吸收较弱,故难以检测到。进一步研究将考虑采用薄层色谱分析法等方法对该3味药材进行定性质量控制。

3.3 银翘散合煎、单煎及散剂的相关性

银翘散配方颗粒合煎制备工艺与单煎制备工艺的特征图谱一致性良好,而银翘散散剂与配方颗粒特征图谱的部分特征峰存在较明显的差异,但银翘散散剂与配方颗粒的药理活性、临床疗效的相关性及差异性尚有待进一步研究。

10批银翘散配方颗粒特征图谱的色谱峰整体上基本一致,表明银翘散配方颗粒提取工艺及制剂工艺较为稳定,保证了制剂成品质量的稳定性和一致性。采用特征图谱进行整体评价,对银翘散配方颗粒质量标准进行了全面提升,能更好地对银翘散配方颗粒的质量进行控制。