针刀干预对中期膝骨关节炎兔软骨下骨压缩力学性能的影响∗

王军美 秦露雪 陈烯琳 钟红刚 刘 聪 尹孟庭 郭长青△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院望京医院，北京 100020）

膝骨关节炎（KOA）是以关节软骨退变、软骨下骨硬化或囊性变、滑膜病变为主要病理变化并涉及膝周软组织病变的全关节疾病，多发于中老年人，以膝关节疼痛和功能障碍为主要临床表现［1］。中国KOA的患病率和致残率高，疾病负担重，严重影响患者身心健康和生活质量［2］。人口老龄化的趋势导致KOA的发病率逐年上升。既往研究多关注于软骨层面，自RADIN等［3］首次提出软骨下骨的厚度、硬度的改变可诱导软骨退变后，软骨下骨在KOA的研究中得到更多的关注。膝关节力学失衡是KOA发病的重要诱因。其中软骨下骨力学性能的改变在OA的发病及进展中的作用不容忽视。在膝关节应力传导中，软骨下骨具有一定的强度以支撑软骨，并富有一定的弹性以缓冲大部分机械应力以保护软骨，维持膝关节的稳定［4］。异常应力下，软骨下骨发生异常重塑导致自身生物力学性能受损，保护软骨功能减弱，加速软骨退变及KOA进展。将软骨下骨作为治疗KOA的新靶点，解除膝关节异常应力，通过抑制软骨下骨重塑改善软骨下骨力学性能来治疗KOA不失为一种新思路。

针刀力学效应可以调整膝关节力学失衡，前期已经证明针刀通过“调筋”恢复关节内良性应力改善软骨退变［5-6］，但针刀对软骨下骨的力学性能是否有调控作用，尚未阐明。因此，本研究通过对软骨下骨压缩力学性能的观察，旨在以软骨下骨为出发点，进一步探讨针刀治疗KOA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康6月龄雄性新西兰兔24只，体质量2.0～2.5 kg，由北京科宇动物养殖中心提供，生产许可证号：SCXK（京）2018-0010。于中国中医科学院中药研究所大实验动物室（SPF级）分笼饲养，室温（20±2）℃，湿度40%～60%，12 h/12 h明暗周期，标准饲料，自由摄食饮水。

1.2 试剂与仪器

戊巴比妥钠（北京百诺威生物科技有限公司）；多聚甲醛（北京化学试剂公司）；EDTA溶液（北京化学试剂公司）；Fast green FCF、Safranine O（美国Sigma公司）；医用压敏胶带（宽0.9 cm，青岛海诺生物工程有限公司）；泡沫双面胶（厚10 mm，上海得力文具有限公司）；树脂绷带（150 mm×1 800 mm，衡水廉洁医疗器械有限公司）；高分子绷带（150 mm×3 600 mm，苏州可耐特医疗科技有限公司）；一次性针刀（0.3 mm×30 mm，北京卓越华友医疗器械有限公司）；一次性无菌针灸针（0.20 mm×13 mm，环球牌，苏州针灸用品有限公司）；韩氏穴位神经刺激仪（LH202H，北京华为产业开发公司）；电子万能力学试验机（WD-1，长春非金属试验机场）；光学显微镜（BX53，日本奥林巴斯公司）。

1.3 分组与造模

适应性饲养7 d后，随机分为空白组、模型组、针刀组和电针组，每组6只。兔禁食10～16 h，由耳缘静脉处按30 mg/kg剂量注射3%戊巴比妥钠溶液，待兔麻醉起效后，牵拉使其左后肢膝关节处于伸直位，采用改良后的Videman法［7］固定制动制备KOA模型。第1层，压敏胶带整体覆盖包裹住膝盖，确保任何粘有兔毛的胶带都不会脱落，将双面泡沫胶缠绕覆盖压敏胶带；第2层，在足踝部、膝关节下方和腹股沟处缠绕一层脱脂棉垫，防止树脂绷带与皮肤产生摩擦；第3层缠绕树脂绷带，从腹股沟至足踝部固定；第4层缠绕高分子绷带，在末端贴上医用胶纸，留出足趾观察血供。最后再缠绕一层防啃咬绷带，同样用医用胶纸固定，防止兔的啃咬破坏，共制动9周。伦理审查机构：中国中医科学院中药研究所，批准号：AN001-T01-2019C005。

1.4 干预方法

各组均拆除树脂固定1周后进行干预。1）空白组：正常饲养3周，每天同干预组一样抓取、捆绑固定。2）模型组：造模后每天同干预组一样抓取、捆绑固定，共3周。3）针刀组：龙胆紫定位后备皮、消毒，采用0.3 mm×30 mm一次性针刀刺入兔左后肢股内、外侧肌腱止点，股直肌肌腱止点，股二头肌肌腱止点和鹅足腱囊，针刀刀刃平行于肌腱，刀体与皮肤垂直刺入，向肌腱与骨的连接方向进行松解，出刀后按压止血，治疗每周1次，共3周。4）电针组：参照《实验针灸学》［8］取穴，采用0.20 mm×13 mm一次性无菌针灸针刺入兔左后肢曲泉、委阳、内膝眼、外膝眼并施以平补平泻法得气后，韩氏穴位神经刺激仪设定波形疏密波、2/100 Hz频率、3 mA强度行电针刺激，分别连接曲泉与委阳、内膝眼与外膝眼，每次15 min，治疗隔天1次，共3周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 取材 治疗结束1周后，将各组兔麻醉后致死，在无菌条件下打开膝关节腔，除去髌骨下滑膜、韧带、半月板等，暴露关节软骨，采用环钻垂直于兔左下肢胫骨平台内外侧中央负重区截取直径8 mm、高度10 mm的软骨-软骨下骨复合体圆柱形组织块。

1.5.2 形态学检测 将软骨-软骨下骨复合体圆柱形组织块置于4%多聚甲醛固定72 h后，置于15%中性EDTA-2Na脱钙两周，再梯度脱水、石蜡包埋、作厚度为5 μm的连续切片。切片采用番红O/固绿染色，以便观察软骨及软骨下骨病理形态，参照Mankin评分标准对软骨退变程度进行评分［9］和病理分期［10］，1～5分为早期骨关节炎，6～9分为中期骨关节炎，10～14分为晚期骨关节炎。

1.5.3 软骨下骨压缩力学测试 1）标本处理：将骨组织的关节软骨以锐刀切下，直至显露出软骨下骨，采用低速骨锯平行锯切圆柱试件端面直至骨面光滑平整，在胫骨平台负重区找准位置后，采用金刚石环钻取高度为3 mm、直径为4 mm的圆柱形骨柱。2）圆柱形骨柱尺寸测试：采用精度0.01 mm的厚度仪测量圆柱形骨柱的原始高度L0。采用精度0.01 mm电子卡尺测试圆柱形骨柱的直径d，分别在上、中、下3个水平，每个水平每隔60°测试1次，共9次取平均值，全部测量均由一名研究者完成以减少误差，根据直径d计算圆柱形骨柱的原始截面积S0。3）压缩测试：采用长春非金属试验机场生产的WD-1材料试验机，设定加载速度2 mm/min，传感器量程500 N。各标本按加载位移分级测试多次，记录初次出现屈服峰的那次测试的载荷-位移曲线，记录最大位移ΔL、最大载荷F、其线性部分（一般取曲线上最大载荷的20%和80%的点连线）斜率k。将所得最大载荷F、标本原始截面积带入压缩强度σ计算公式：

将所得曲线斜率k、标本原始截面积S0、标本原始高度L0代入弹性模量E计算公式：

1.6 统计学处理

应用SPSS21.0对所得数据进行统计分析，计量资料以（±s）表示。所有数据先进行Shapiro-Wilk正态性检验、Levene′s test方差齐性检验。满足正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析；否则采用Krus⁃kal-Wallis非参数检验。P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

2 结 果

2.1 实验动物数量分析

实验过程中，各组兔无死亡和感染情况，共24只兔可进入分析。

2.2 组织形态学评价

2.2.1 各组兔软骨-软骨下骨复合体染色光镜结果 空白组软骨层基质被蕃红O染色，呈均匀红色，结构完整、厚度正常，潮线清晰而完整，软骨细胞规律排列，无软骨细胞簇集现象，无血管翳生成。软骨下骨被固绿染成蓝色，软骨下骨板厚度正常。模型组软骨层基质淡染，软骨层明显变薄，软骨细胞排列紊乱，呈现肥大增殖、簇集现象，潮线缺损，破坏甚至消失，软骨下骨板厚度明显增加。针刀组、电针组软骨细胞排列较为规则，层次可分，细胞轻度增生，部分区域有簇集现象，潮线尚完整，稍有或未有血管翳生成，软骨下骨板轻度增厚。见图1。

图1 各组兔膝关节蕃红O/固绿染色图（40倍）

2.2.2 各组兔软骨Mankin评分 造模后，模型组Mankin评分较空白组显著升高（P<0.01）。经针刀、电针干预后，两组Mankin评分较模型组显著降低（P<0.01），针刀组Mankin评分较电针组低，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。中期骨关节炎的Mankin评分为6～9分，模型组6个样本的Mankin评分均在6～9分之间，符合中期骨关节炎的病理改变。

表1 各组兔关节软骨Mankin评分比较（分，±s）

表1 各组兔关节软骨Mankin评分比较（分，±s）

注：与空白组比较，∗P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与电针组比较，#P<0.01。下同。

Mankin评分0 8.17±0.75*3.33±1.03*△△#5.17±1.17*△△组别空白组模型组针刀组电针组n6 6 6 6

2.3 软骨下骨压缩力学性能测试

见表2。与空白组相比，模型组兔膝关节软骨下骨最大位移、最大载荷、压缩强度和弹性模量显著降低（P<0.01）。与模型组相比，针刀组膝关节软骨下骨最大位移、最大载荷、压缩强度、弹性模量显著升高（P<0.01或P<0.05）；电针组膝关节软骨下骨最大位移、最大载荷、压缩强度和弹性模量显著升高（P<0.05）。针刀组与电针组相比，软骨下骨最大位移、最大载荷、压缩强度和弹性模量上升，两组之间差异无统计学意义（P>0.05），但针刀组趋势更接近正常组。

表2 各组兔软骨下骨压缩力学性能参数比较（±s）

表2 各组兔软骨下骨压缩力学性能参数比较（±s）

组别空白组模型组针刀组电针组n 6 6 6 6最大位移（mm）0.22±0.01 0.18±0.01*0.21±0.01△△0.20±0.01△最大载荷（N）161.25±17.62 117.03±17.24*145.71±15.82△140.03±19.24△压缩强度（MPa）12.51±1.07 9.57±1.40*11.52±1.11△11.22±1.21△压缩模量（MPa）317.21±20.54 268.13±12.28*312.50±23.43△297.58±26.01△

3 讨 论

膝关节力学失衡是KOA发生发展的重要诱因。本研究采用改良后的Videman法左后肢伸直位固定制动造模，能复制出因膝关节力学失衡导致的KOA模型，通过限制兔膝关节的活动，使膝周软组织收缩，直接增加关节软骨的压力，膝关节应力异常，关节软骨破坏，加速KOA的形成［10］。造模后，模型组兔膝关节番红O/固绿染色显示软骨结构紊乱、破坏，出现典型病理退变，Mankin评分较空白组明显升高。本研究在软骨退变的基础上，还观察到制动造模使KOA兔膝关节软骨层明显变薄、软骨下骨板明显增厚。

软骨下骨与软骨在OA的发病及进展过程中互为因果。软骨-钙化软骨-软骨下骨组成的骨单元是膝关节重要的应力传导系统，软骨下骨富有一定的强度（承载负荷而自身不被破坏的能力）和弹性（外力作用下抵抗变形的能力），在生理负重情况下，软骨下骨的力学功能为吸收、缓冲来自软骨的应力，并将应力负荷向下及关节周围组织传递，保护关节软骨［11］。软骨下骨能通过骨重塑——由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成处于动态平衡而维持了软骨下骨骨量和结构的稳定，来不断适应力学环境的变化。异常应力下，软骨下骨骨吸收/骨形成失衡，表现为异常的骨重塑，通常伴有生物力学性能的下降。软骨下骨承担载荷和抗变形的能力下降，将减弱其缓冲震荡的能力，可使上覆的软骨受到异常的剪切力和张力，导致继发性软骨损伤和退变，在软骨受到损伤后，又反作用于下面的软骨下骨造成应力增加、损伤加重，最终形成一个恶性循环［12］。由此可见，软骨下骨的生物力学性能对KOA的发生发展具有重要作用。通过抑制软骨下骨异常重塑改善软骨下骨力学性能，是治疗KOA的潜在靶点。

压缩试验是测试骨组织力学性能的代表性方法之一。骨组织受力（载荷）则会变形（位移），压缩强度代表物体在承担负荷的情况下抵抗破坏的能力，弹性模量代表在应力作用下抵抗变形的能力。压缩力学测试结果显示，中期膝骨关节炎模型兔软骨下骨最大位移、最大载荷、压缩强度和弹性模量显著降低，软骨下骨的强度和弹性显著下降，说明其力学性能受损，骨质量下降，软骨下骨产生退变。董启榕等［13］复制兔膝关节不稳模型发现OA的各个阶段都出现软骨下骨力学性能的异常，其硬度和强度会呈现先降低然后逐渐增高的趋势。软骨下骨的力学性能取决于骨量、骨质、骨小梁结构排列以及材料成分（矿物和胶原蛋白）［14］。早期软骨下骨力学性能下降与高活性状态的骨吸收导致软骨下骨骨质疏松、骨小梁变薄、骨板厚度减少有关［15］。随着疾病的发展，骨形成活跃导致骨量净增加，软骨下骨的骨体积增加，软骨下骨骨小梁的形态由棒状转变成板状，骨小梁厚度增加，这在影像学检查中被视为骨硬化，软骨下骨力学性能逐渐增高，但骨转换率异常增高会伴随新生的骨组织矿化不全，导致骨小梁虽然更厚但更少的情况，实际上软骨下骨的生物力学特性减弱［12］。

KOA是一种筋骨共病、痿痹共存的疾病［1］。在发病机理方面，“经筋”先遭受病因的侵袭，“宗筋主束骨而利机关”（《素问·痿论》）的生理功能丧失累及膝“骨”，导致筋骨共病的结果。针刀作为KOA治疗的有效方法之一被2020年版《膝骨关节炎中医诊疗指南》推荐［1，16］。针刀治疗KOA除了能有效地镇痛、抗炎，其独特优势在于通过对粘连、挛缩的组织进行松解以恢复膝关节力学平衡，改善膝关节功能受限问题。其通过对膝周韧带、肌腱及髌骨内外支持带等进行松解，改善肌肉-肌腱生物力学特性，发挥调筋作用，通过“调筋”恢复关节内良性应力，促进软骨细胞合成代谢，保护软骨即发挥“治骨”作用［5-6］。经针刀、电针干预后，软骨染色情况改善，Mankin评分显著降低，说明针刀、电针对KOA兔软骨损伤有保护作用，且针刀效果优于电针；软骨下骨的最大位移、最大载荷、压缩强度、弹性模量显著降低，说明针刀干预可以改善软骨下骨承担载荷和抗变形的能力，且针刀和电针相比，针刀组的力学性能改善情况更好。其机制可能是针刀力学效应抑制了软骨下骨异常重塑从而改善了软骨下骨的力学性能。

综上所述，针刀干预可改善KOA兔软骨下骨的压缩力学性能，从而延缓KOA进程。但本实验仍存在不足，压缩力学性能只能宏观地反映软骨下骨的骨量和骨质水平，而缺少对软骨下骨骨量、骨质以及微观结构变化的观察，在今后的实验中可进一步通过影像学的指标观察诸如X光片、Micro-CT等，以期能更充分地、更深入地探讨针刀干预KOA对软骨下骨结构和功能的调控作用。