正交试验优选镇眩方提取纯化工艺

黄秋狄，孙继秋，万细岚，谢家翠，黄 佩，周 毅

（1.广州医科大学药学院，广州 511435；2.江西省吉安市吉水县白水镇卫生院，吉安 331617；3.江西省抚州市东乡区疾控中心，抚州 331800）

眩晕是一种运动性的神经错觉，是一类多发、常见的症状表现。患者发病时感到头晕，同时伴有恶心呕吐、视物旋转等症状，具有明显的主观不适感[1]。李妍怡[2]从血瘀、痰浊、虚证3个方面论治由恣食肥甘、劳倦太过引起的痰眩取得了满意的疗效。镇眩方由甘草、白芍、桂枝、川芎等药材组成，具有养血利水、重镇止眩的功效，对耳源性眩晕、眼源性眩晕和椎底动脉供血不足引起的眩晕，均有较好的疗效[3]。有研究[4]用镇眩汤治疗90例眩晕症，治愈49例，显效58例，有效38例，无效5例，总有效率为96.7%；服药时间最短15 d，最多62 d，平均28 d，未见副作用。

镇眩方原为煎煮汤剂，但汤剂存在煎煮过程繁琐、不易携带、口感不好等缺点。为解决这些问题，本课题拟对镇眩方进行改进和优化。在前期超临界CO2萃取桂枝、川芎等药材的基础上[5]，对处方其余药材和超临界萃取残渣进行了提取纯化研究，以其提取物浸膏得率和具有消炎镇静作用的芍药苷[6]、甘草苷[7]的含量为指标，采取正交试验设计优选镇眩颗粒的最佳水提和醇沉工艺，为后续镇眩方的进一步研发提供基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

UC25-12TPA型超声波清洗机（宁波市双嘉仪器有限公司）；星烁牌C型玻璃仪器气流烘干器（广州市星烁仪器有限公司）；HH，SII-NI6B型电热恒温水浴锅（北京精科华瑞仪器有限公司）；ME104型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；HZT-A500型电子天平（福州华志科学仪器有限公司）；电热鼓风真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；超临界CO2萃取装置（环球分析测试仪器有限公司）；高效液相色谱仪（岛津有限公司）。

1.2 药品与试剂

甘草苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司）、芍药苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司）、甘草（甘肃宝芝林农业科技有限公司）、白芍（安徽协和成药业饮片有限公司）、熟地黄（郑州瑞龙制药股份有限公司）、茯苓（安徽协和成药业饮片有限公司）。标准品纯度为97%以上；乙腈为色谱纯，其余溶剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 甘草苷和芍药苷含量测定

2.1.1 色谱条件 Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈-水（20∶80）为流动相；检测波长为230 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为40℃；进样量20μL。理论板数按甘草苷、芍药苷峰计算，应不低于2 000。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定甘草苷、芍药苷对照品0.230 mg，置10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取药材适当粉碎，合并超临界萃取药渣，加入9倍量的水，回流提取1 h，2次。浓缩提取液至一定浓度，加入乙醇，醇沉浓度50%，醇沉24 h，过滤，浓缩至干浸膏。置于50 mL容量瓶中，蒸馏水定容，超声30 min，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

2.1.4 阴性对照品溶液的制备 按处方比例（不含甘草、白芍）称取药材适量，按“2.1.3”项下方法制成阴性对照品溶液。

2.1.5 系统适应性实验和专属性实验 分别精密吸取甘草苷和芍药苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。结果表明甘草苷保留时间为10.50 min，芍药苷保留时间为7.50 min，甘草苷、芍药苷与供试品其他组分分离度良好（R>1.5），阴性对照品无干扰，见图1。

图1 镇眩方中芍药苷、甘草苷HPLC谱图

2.1.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液不同体积置于10 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容，制成浓度梯度分布的系列溶液，摇匀，在“2.1.1”项色谱条件下记录峰面积。以色谱峰面积为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到甘草苷回归方程：y=15 269x-8 489.7，R2=0.999 9，表明甘草苷在2.00～100.00μg.mL-1呈良好的线性关系；得到芍药苷回归方程为y=33 545x-31 494，R2=0.999 9，表明芍药苷在4.08～204.00 g·mL-1呈良好的线性关系。

2.1.7 精密度考察 取“2.1.2”项对照品溶液，重复进样6次，每次精密吸取20μL，记录甘草苷、芍药苷的峰面积，并计算RSD值。结果表明，甘草苷RSD值为1.19%（n=6），芍药苷RSD值为0.66%（n=6），精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h时，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，甘草苷面积的RSD为1.87%（n＝6），芍药苷面积的RSD为0.46%（n＝6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验 精密称取同一批水提醇沉浸膏6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算甘草苷、芍药苷含量。结果，甘草苷的RSD值为2.34%（n=6），芍药苷的RSD值为2.91%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.1.10 加样回收试验 精密吸取供试品溶液2 mL，分别精密加入混合对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果，甘草苷的平均回收率及RSD分别为89.15%、1.09%，芍药苷的平均回收率及RSD分别为101.52%、3.47%。

2.1.11 样品的测定 精密称取正交试验浸膏样品适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算甘草苷和芍药苷含量。每批样品平行测定3次，取平均值作为测定结果。

2.2 正交试验优化水提工艺

2.2.1 水提工艺设计[8-9]选定液料比、提取时间、提取次数为考察因素，以甘草苷提取率、芍药苷提取率和出膏率为考察指标，选用L9（34）正交表进行试验设计，因素水平见表1。

表1 水提工艺正交因素水平表

2.2.2 正交试验结果及分析 甘草苷和芍药苷是镇眩方中的活性成分，将其权重系数分别设为0.35，此外由于浸膏得率也是考察提取工艺的一个重要指标，故将其权重系数也设为0.35。

由正交试验直观分析可知（表2），以综合评分为考察指标时，各因素对水提效果的影响依次为C（提取次数）＞A（液料比）＞B（提取时间），各因素水平影响为A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C3＞C2＞C1。通过方差分析表（表3）进一步分析，液料比、提取时间和提取次数差异均有统计学意义。综合评分表明最佳水提工艺为A3B2C3，但是考虑该工艺提取能耗较高，且A3和A2，C3和C2间的水提效果差异不明显，综合考虑，选取最优水提工艺为A2B2C2，即9倍量的水，提取2次，每次1.5 h。

表2 水提工艺正交试验结果

表3 水提工艺综合评分方差分析

2.2.3 验证试验 按照处方比例，称取药材80 g（40 g为超临界萃取残渣），加9倍量的水煎煮两次，每次1.5 h，合并滤液浓缩至黏稠状态，105℃干燥5 h，称重，进行三次重复实验。测得平均浸膏得率为41.46%，平均芍药苷提取率为63.15%，平均甘草苷提取率为58.96%，与正交试验相比较，结果表明验证实验结果各指标成分均达到较高水平，该提取工艺稳定、合理、可行，见表4。

表4 水提工艺正交试验验证结果

2.3 正交试验优化醇沉工艺

2.3.1 醇沉工艺设计[10-11]选定浸膏密度、醇沉浓度、醇沉时间为考察因素，以甘草苷转移率、芍药苷转移率和出膏率为考察指标，选用L9（34）正交表进行试验设计，见表5。

2.3.2 正交试验结果及分析 由正交试验直观分析可知，以综合评分为考察指标时，各因素对醇沉效果的影响依次为B（醇沉浓度）＞A（浸膏密度）＞C（醇沉时间），各因素水平影响为A2＞A3＞A1，B3＞B1＞B2，C3＞C2＞C1。方差分析结果显示，浸膏密度、醇沉浓度差异均有统计学意义，醇沉时间对醇沉效果差异没有统计学意义（P＞0.05）。综合考虑，选取最优醇沉工艺为A2B3C1，即浸膏密度为1.04～1.08 g·mL-1，醇沉浓度为90%，醇沉时间为24 h，见表6、7。

表6 醇沉工艺正交试验结果

2.3.3 验证试验 按照1/3处方比例，称取药材，加9倍量的水煎煮两次，每次1.5 h，合并滤液浓缩至密度1.04～1.08 g·mL-1，加入乙醇量90%，静置24 h。过滤浓缩至黏稠状，105℃干燥5 h，称重，进行三次重复实验。测得平均浸膏得率为13.66%，平均芍药苷转移率为78.71%，平均甘草苷转移率为71.10%，与正交试验相比，验证实验结果的各指标成分均达到较高水平，表明该提取工艺稳定、合理、可行，见表8。

表7 醇沉工艺综合评分方差分析

表8 醇沉工艺正交试验验证结果（%）

3 讨论

镇眩汤以汤剂的形式用于临床多年，获得了良好疗效[4]。现代中药研究表明，组成该方的十味（其中两味为龙骨和牡蛎）中药多含有大量的水溶性多糖和苷类成分，比如地黄中的寡糖、当归中的当归多糖、白术中的白术多糖、茯苓中的茯苓多糖等，都具有造血、提高免疫、镇痛及调节胃肠运动等功能，因此初步确定使用水提取更为方便。除此之外，现代药理研究还发现该方中药中所含的小极性成分，比如地黄中的环烯醚萜苷，当归中的蒿苯内酯、5-羟甲基糠醛（降血压效果是由5-羟甲基糠醛、鞣酸、腺苷和牛磺酸等组分共同作用的结果），白术中的白术内酯等都具有较强的活性，其中川芎中的川芎嗪有较显著的镇静和镇痛作用。因此可结合使用超临界萃取技术有效地提取这些小极性物质。本次研究在超临界萃取的基础上将甘草、白芍、熟地黄、茯苓协同超临界萃取残渣采用水提、醇沉的方式，尽可能多的提取有效成分，保证药效，同时也尽可能保证其与临床作为汤剂使用时的相同功效。

本研究在宏观上采用浸膏得率控制，微观方面以甘草苷和芍药苷含量作为考察指标，分别赋予0.35的权重系数进行综合评分，优选提取工艺主要考虑三者在其中的重要性。镇眩方中起作用的成分很多，甘草苷、芍药苷分别是甘草和白芍的主要活性成分，而且甘草苷[12-13]和芍药苷[14]还对引起眩晕的疾病具有一定的疗效。另外，将极性相近的芍药苷、甘草苷在同一个条件的HPLC色谱中跑出，不但能很好地监测提取纯化的效果，同时也节约了操作过程中的成本。

醇沉法利用有效成分能溶于乙醇而杂质不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，有效成分溶于乙醇而杂质则被沉淀出来，醇沉的目的是除去杂质保留药物有效成分。尽管目前已经有许多纯化的方法，但因醇沉的优势，其在药企仍然占有很重要的地位[15]。中药材中多糖、淀粉等含量相对较高，也容易被水提提取出来，使提取的浸膏黏稠度大、体积多，且这些杂质容易造成制剂不稳定、不易保存，使溶液易产生沉淀，所以后续进行了醇沉除杂工艺的研究。研究结果表明，通过正交试验选取的水提、醇沉工艺重复性好，可操作性强，但还需要结合药理药效的数据进一步确定最终工艺，相关研究将在下一步完成。