外源褪黑素处理对采后荔枝生理品质的影响

谢晶，潘家丽，卢献婷，覃子倚，李静，董新红

（桂林理工大学化学与生物工程学院，广西 桂林 541004）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是东南亚和南亚国家具有重要经济价值的水果作物，在我国的广东和福建南部种植最为广泛[1-2]。荔枝因果皮色泽鲜艳，风味和口感独特，营养价值高，备受消费者青睐[3]。但荔枝成熟于炎热潮湿的夏季，室温下贮藏会导致果皮在2 d～3 d内迅速褐变；而且采后呼吸代谢旺盛，失水作用加剧，使果实在贮运过程中严重腐烂变质，严重影响果实品质和经济价值[4-5]。

褪黑素是植物体内的抗氧化剂和高效的自由基清除剂。近几年，褪黑素对植物生长调节的影响逐渐成为热点，但关于褪黑素在果蔬采后保鲜上的应用研究较少。童瑶等[6]研究表明褪黑素可以高效清除活性氧自由基，调控果蔬的成熟与衰老，保持果蔬的品质；黄陈珏等[7]发现褪黑素可以提高樱桃、番茄的可溶性固形物含量；同时千春录等[8]发现外源褪黑素不仅可以保持水蜜桃的硬度与色泽，而且能降低果实受到的氧化损害，以及抑制果实抗坏血酸的降解等，可以有效保持桃的贮藏品质；Liu等[9]发现褪黑素可以提高草莓的抗氧化能力，保持其较好的品质。所以，将褪黑素应用于果蔬的保鲜，能有效清除活性氧，激活果蔬内部的抗氧化能力。目前，国内外将褪黑素应用于荔枝的研究还比较少，但褪黑素作为一种天然、安全的果蔬保鲜剂，研究其在果蔬采后保鲜中的应用具有重要意义。本文以“妃子笑”荔枝为试验材料，以褪黑素处理荔枝，测定荔枝果实生理指标的变化，研究褪黑素对荔枝采后品质的影响，以期为褪黑素用于果蔬采后保鲜提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

荔枝：广西壮族自治区桂林市某果园，采摘外观大小一致，没有机械损伤、病虫害，表面无破损的优质“妃子笑”荔枝；褪黑素、还原型/氧化型谷胱甘肽（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、过氧化氢、丙酮、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、浓盐酸、冰醋酸、磷酸、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

3K3冷冻离心机：德国Sartorious公司；722PC可见光分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；TU-50紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3E电导率仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；NR110色差仪：深圳市三恩时科技有限公司；LRH-25-Z恒温培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；Seven multi pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Universal TA质构仪：上海腾拔仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 处理方法

选成熟度相近、大小一致的荔枝，清洗干净后，在室温（25℃）下置于0.1%的咪酰胺溶液中浸泡3 min后，取出晾干后，参考Zhang等[10]方法，用0.4 mmol/L的褪黑素浸泡3 min，以清水处理为对照组（control group，CK），晾干后用厚度为0.11 mm的PE保鲜袋装好，4℃条件下贮藏，每隔 4 d取样一次（即 0、4、8、12、16 d），取样当天分别测定处理组与对照组的褐变指数、失重率、细胞膜通透性和色泽指数，每个处理做3次重复，剩余荔枝果皮经液氮速冻研磨打碎后于-80℃冷冻贮藏备用，用以后续测超氧阴离子产生速率、膜透性、丙二醛含量、花青素含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性等生理指标。

1.3.2 失重率的测定

贮藏开始时的质量记为M（1g），贮藏一段时间后（分别为0、4、8、12、16 d）的质量记为M（2g）；失重率计算公式如下。

1.3.3 褐变指数的测定

参考张茜等[11]方法，采用分级法根据荔枝褐变的面积，将荔枝果皮的褐变面积分为4级，无褐变的为0级，轻微褐变（0%～24%）为1级，中度褐变（25%～50%）为2级，重度褐变（51%～75%）为3级，严重褐变（76%～100%）为4级。每次选20个果测定，每4 d测定一次。果皮褐变指数计算方式如下。

1.3.4 色度的测定

参考王甜[12]的方法，果皮色泽的测定使用色差仪进行，数值基于CIE系统以L*、b*、c*、h*值表示。L*值表示颜色的亮度，b*值表示色泽从蓝色到黄色的范围，c*值表示色彩的饱和度，h*值表示颜色的色调。每组取20个荔枝，测定3次。

1.3.5 超氧阴离子（O2-）产生速率的测定

称取2 g果皮，加入10 mL 50 mmol/L、pH7.8的磷酸缓冲液，混匀振荡20 s后，冰浴条件下提取10 min，随后于4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液备用，超氧阴离子产生速率参考刘帅民等[13]的方法。

1.3.6 膜透性的测定

对照组和处理组分别取5个荔枝的果皮，每个果皮上切取3片大小、厚度一致的荔枝果皮圆片，参照蔡佳昂等[14]的方法并加以改进测定相对电导率，20 mL的蒸馏水中加入果皮圆片，于室温摇床振荡1 h，此时测定液体的电导率X1，然后将其煮沸25 min，等待其降至室温后，再次测定其电导率X2，重复3次，取平均值。相对电导率（y）计算如下。

1.3.7 MDA含量的测定

参考梁芸志等[15]的方法并加以改进测定丙二醛含量。称取果皮2 g，采用TBA显色法，放入50 mL的离心管，在冰浴条件下加入10 mL 10%三氯乙酸，振荡20 s后，冰浴静置提取10 min，于4℃下12 000 r/min离心20min，取上清液2mL于10mL的离心管中，再加入2mL0.6%的硫代巴比妥酸溶液，混合均匀后在沸水浴中反应20min，待降至室温后，以0.6%的TBA溶液为空白，冷却至室温，测定450、532、600nm处的吸光度。

1.3.8 花青素含量的测定

参考陈程莉等[16]的方法并加以改进，称取2 g果皮，采用pH差示法测量花青素含量，用KCl和CH3COONa分别配制成pH1.0和pH4.5的缓冲溶液，将待测液用乙醇定容至10 mL，分别于520 nm和700 nm下测吸光度。

1.3.9 SOD活性和CAT活性的测定

将2 g荔枝果皮加入到10 mL 0.1 mol/L、pH7.8磷酸缓冲液（含5 mmol/L二硫苏糖醇和5%聚乙烯吡咯烷酮）中旋涡振荡30 s，然后冰浴10 min，于4℃下12 000 r/min下离心30 min，收集上清液，参考Jin等[17]的方法进行超氧化物歧化酶活性测定，采用氮蓝四唑光还原法，以每分钟对氮蓝四唑光化反应抑制50%为一个酶活单位；过氧化氢酶活性参考Zhang等[18]的方法，以每克果蔬每分钟减少0.01为一个酶活单位。

1.3.10 POD活性的测定

参考Zhang等[19]的方法并加以改进，将2 g荔枝果皮加入到10 mL 0.1 mol/L、pH7.8的乙酸缓冲液（含4%聚乙烯吡咯烷酮、1%曲拉通X-100和1 mmol/L聚乙二醇）中漩涡振荡20 s，冰浴提取10 min，在4℃条件下12 000 r/min离心30 min，取上清液待测。过氧化物酶活性以每克果蔬每分钟吸光度上升0.1作为一个酶活力单位（U）。

1.3.11 PPO活性的测定

称取2 g荔枝果皮，加入10 mL 0.1 mol/L、pH7.8的乙酸-乙酸钠缓冲液（含4%聚乙烯吡咯烷酮、1%曲拉通X-100和1 mmol/L聚乙二醇），漩涡振荡20 s，冰浴提取10 min，于 4℃、12 000 r/min离心 30 min，取上清液作为酶提取液待测，参考周亨乐等[20]的方法测定多酚氧化酶活性，酶活性以每克果蔬每分钟吸光度增加0.1作为一个酶活力单位（U）。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，数据采用平均值±标准差表示。采用Excel软件进行数据整理，用SPSS 23.0进行相关性分析，因子分析，用Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对荔枝采后生理的影响

2.1.1 不同处理对荔枝生理品质及外观色度的影响

不同处理对荔枝生理品质及外观色度的影响见表1。

表1 不同处理对荔枝生理品质的影响Table 1 Effects of different treatments on physiological quality of litchi

续表1 不同处理对荔枝生理品质的影响Continue table 1 Effects of different treatments on physiological quality of litchi

由表1可知，随贮藏时间延长，荔枝对照组和褪黑素处理组的采后失重率和褐变指数整体呈上升趋势，贮藏末期（16 d）对照组的失重率是褪黑素处理组的1.38倍；对照组的褐变指数是褪黑素处理组的1.42倍。其中对照组荔枝失重率和褐变指数均整体极显著（P＜0.01）高于褪黑素处理组的荔枝，这可能是褪黑素处理使荔枝呼吸作用减弱，荔枝的失水减缓，使其更有效地维持荔枝的表皮结构，保持荔枝良好的外观品质。荔枝果皮水分含量高，它采后旺盛的呼吸作用易导致其重量的损失，褐变加剧，且有研究表明失重率越高，营养物质损失越多[21]，严重影响其外观和品质，所以失重率和褐变指数是评价采后果蔬贮藏品质的一个重要指标和特征。

色度不仅能影响荔枝的外观，同时是评价荔枝品质的一个直观指标。而且色泽是贮藏期间感官品质的重要指标之一[22]。在贮藏期间，对照组和褪黑素处理组的荔枝的果皮色泽呈下降趋势，果皮L*值从最初的43.14逐渐下降，在贮藏16 d时到达最低值，其中对照组整体下降21.49%，褪黑素处理组整体下降15.02%，褪黑素处理组和对照组呈极显著差异（P＜0.01），说明褪黑素处理组能有效抑制L*值的下降。千春录等[8]研究也发现褪黑素处理可以延缓L*值的下降，阻止水蜜桃褐变。

2.1.2 不同处理组对荔枝活性氧代谢和膜脂过氧化的影响

果蔬贮藏期间产生的O2-极容易导致不饱和脂肪酸发生膜脂过氧化反应，间接地加速果蔬的老化，因此O2-产生速率是衡量果蔬成熟程度的重要指标之一[8]。由表1可知，随着贮藏时间的延长，荔枝的超氧阴离子产生速率呈上升趋势（除12d外），在16 d时，对照组和褪黑素处理组均出现峰值，分别为1.73 μmol/（min·g）和1.39 μmol/（min·g）。其中，褪黑素处理组极显著低于对照组（P＜0.01），表明褪黑素可以明显抑制活性氧物质的增加，阻止活性氧对荔枝细胞膜造成脂质过氧化，对荔枝采后品质有一定保护作用。

荔枝的细胞膜透性用相对电导率表示。由表1可知，对照组和褪黑素处理组的荔枝的初始相对电导率为14.14%，随着荔枝贮藏时间的延长，荔枝果皮的相对电导率整体呈上升趋势，这表明果皮细胞膜的完整性被破坏，细胞电解质的渗漏。对照组与褪黑素处理组在贮藏前期（0～8 d）相对电导率增加缓慢，在贮藏后期（8 d～16 d）相对电导率急速上升，在16 d时均达到峰值，分别是36.88%和29.40%，且对照组的相对电导率在贮藏后期明显高于褪黑素处理组（P＜0.01），说明褪黑素处理能更好地保持果实细胞膜的完整，对荔枝存在一定的保鲜效果。何欢等[23]研究也发现在低温贮藏环境下，杏的膜透性增加，膜内电解质外渗，而褪黑素能有效抑制杏的膜透性增加，保持其生理品质。

MDA是膜质过氧化最重要的产物之一[24]，MDA累积会造成膜损伤，所以MDA可以作为评价荔枝采后损伤的指标[25]。在贮藏后期（12 d后）褪黑素处理组的MDA含量极显著低于对照组（P＜0.01），在贮藏末期（16 d）时，褪黑素处理组（6.77 μmol/L）比对照组（8.02 μmol/L）低了15.59%，说明在贮藏后期，褪黑素能降低膜脂过氧化造成的细胞膜损伤，即能延缓果实衰老。

POD是果蔬氧化褐变的重要参与酶，且POD能利用活性氧自由基加速果蔬内酚类物质的氧化，促使果皮变色[26]。在0～16 d贮藏期间，对照组与褪黑素处理组的酶活呈现显著差异（P＜0.05），褪黑素有效降低了POD活性。其中在贮藏16 d时，对照组POD活性是褪黑素处理组的1.17倍，荔枝POD活性的降低，可能是贮藏末期荔枝衰老导致的代谢能力下降，POD活性减弱。结果表明在贮藏期，褪黑素处理能有效抑制荔枝POD活性的升高，减缓果皮的褐变速度，保持果实良好的贮藏品质。

PPO是促使荔枝褐变的重要因素之一[27]，对照组荔枝的PPO活性随贮藏时间的延长整体呈先上升后下降的趋势，在贮藏8 d时达到最高值（0.60 U/g），这可能是荔枝体内膜脂过氧化程度加深，细胞膜破损导致的，而褪黑素处理组整体较平稳地下降。在贮藏前期（8d前），褪黑素处理组的PPO含量略低于对照组，而贮藏后期对照组的PPO活性与褪黑素处理组无明显差异（P＞0.05）。因此，褪黑素处理对荔枝PPO活性在贮藏前期具有一定抑制作用。

2.1.3 不同处理对荔枝抗氧化酶活性的影响

花青素是荔枝的重要营养物质[28]，具有很强的抗氧化能力。由表1可知，对照组和褪黑素处理组的荔枝花青素含量在贮藏期间呈下降趋势，这可能是因为着色物质的降解，花青素合成酶活性降低，花青素的合成代谢被抑制所导致的。荔枝花青素含量在贮藏末期（16 d）降到最低点，此时褪黑素处理组的花青素含量高于对照组75.0%，说明褪黑素组对荔枝花青素含量具有较好维持作用，抑制花青素的降解，对荔枝的衰老褐变有很好的抑制效果。

SOD和CAT都是果蔬体内最重要的自由基清除酶[29]，不仅能增强荔枝的抗氧化性，而且能维持果蔬体内的代谢平衡，延缓果蔬的衰老进程。对照组荔枝SOD活性在贮藏前期（0～8 d）呈上升趋势，在8 d时达到峰值1.95 U/g，在贮藏后期（8 d～16 d）呈下降趋势，而褪黑素处理组SOD活性呈直线上升趋势，在贮藏16 d时达到峰值2.21 U/g。与此同时，对照组和褪黑素处理组荔枝的CAT活性随贮藏时间延长均先上升后下降，在8 d时达到峰值，褪黑素组活性比对照组提高了24.96%。其中，褪黑素处理组的SOD活性和CAT活性均显著（P＜0.05）高于对照组，说明褪黑素处理能诱导荔枝的SOD和CAT的活性升高，增强活性氧清除能力，降低活性氧自由基对组织细胞的损伤，提高荔枝的抗氧化能力，延缓荔枝的衰老褐变，进而保持果实的贮藏品质。何欢等[23]研究表明100 μmol/L的褪黑素可以有效提高杏果实的SOD和CAT活性。

2.2 相关性分析

利用SPSS软件对荔枝采后品质相关的各生理指标进行相关性分析[30]，荔枝各指标相关性分析结果如表2所示。

表2 各生理指标间的相关性分析Table 2 Correlation analysis between various physiological indicators

由表2可知，荔枝贮藏时间和失重率、褐变指数、相对电导率、丙二醛含量、O2-产生速率呈极显著正相关（r=0.975，r=0.917，r=0.864，r=0.803，r=0.778，P＜0.01），与SOD活性呈显著正相关（r=0.647，P＜0.05），说明荔枝的失重率、褐变指数、相对电导率、丙二醛含量、O2-产生速率和SOD活性跟贮藏时间有极大的关联，这6个指标能反映荔枝采后贮藏期的生理品质；荔枝的贮藏时间和L*、花青素含量呈极显著负相关（r=-0.921，r=-0.880，P＜0.01），与PPO活性呈显著负相关（r=-0.720，P＜0.05），由此可见 L*值、花青素含量和 PPO 活性的变化反映了荔枝褐变和外观色度变化与贮藏时间的关系。

褐变指数与失重率、相对电导率、O2-产生速率也呈极显著正相关（r=0.952，r=0.962，r=0.843，P＜0.01），与 L*值和花青素含量呈极显著负相关（r=-0.961，r=-0.913，P＜0.01），说明荔枝生理指标相互间有极大的关联性。

2.3 主成分分析

通过SPSS 23.0作荔枝贮藏期间的主成分分析，荔枝各主成分的方差贡献率、累积方差贡献率见表3。

表3 主成分特征值和方差贡献率Table 3 Principal component eigenvalue and variance contribution rate

从表3可知，特征值大于1的共有3个主成分，第一主成分贡献率为62.150%，第二主成分贡献率为20.344%，第三主成分贡献率10.218%，第一和第二主成分累计方差贡献率82.494%（＞80%），说明第一和第二主成分能代表荔枝生理指标的大部分信息，因此选用这2个主成分代表荔枝的主要品质。

各主成分之间载荷关系见表4。

表4 主成分载荷矩阵Table 4 Component matrix

由表4可知，失重率、褐变指数、相对电导率、O2-产生速率和丙二醛含量在第1主成分正坐标处具有较高载荷，L*值、花青素含量和PPO活性在负坐标处载荷较高，说明第1主成分主要反映了这8个指标的信息；SOD活性和CAT活性在第2主成分正坐标处有较高载荷，POD活性在负坐标处有较高载荷，说明第2主成分主要代表SOD活性和CAT活性以及POD活性这3个指标。根据载荷绝对值的大小可知，在第1主成分中贡献率大小为失重率＞褐变指数＞L*值＞相对电导率＞花青素含量＞O2-产生速率＞丙二醛含量＞PPO活性；而第2主成分中贡献率比较结果为CAT活性＞SOD活性＞POD活性。

荔枝冷藏期间的11个生理生化指标的载荷图见图1。

图1 荔枝主成分的因子载荷图Fig.1 Factor load diagram of principal components in litchi

荔枝失重率、褐变指数、相对电导率、O2-产生速率、丙二醛含量、L*值、花青素含量和PPO活性等离PC1轴（67.431%）（即Y轴）较远，说明这8个指标对第1主成分的贡献很大，其中失重率、褐变指数、L*值距离Y轴的绝对值较高，即对第1主成分贡献最大；SOD活性、CAT活性和 POD活性则离PC2轴（16.530%）（即X轴）绝对值较高，表明SOD和CAT以及POD活性对第2主成分的贡献较大，其中CAT明显离X轴最远，即对第2主成分贡献最大。将载荷图与载荷矩阵两者结合，可以得出荔枝品质的核心指标是失重率、褐变指数、L*值和CAT活性。且在采后贮藏期，褪黑素处理过的荔枝的失重率和褐变指数显著低于对照组，L*值和CAT活性明显高于对照组。综上，褪黑素处理确实可以提升荔枝采后的品质，达到保鲜的效果。

3 结论

本研究采用0.4 mmol/L褪黑素处理采后荔枝，通过对荔枝生理指标的分析，探究褪黑素对荔枝采后品质的影响。研究表明，在4℃贮藏环境，随着贮藏时间的延长，荔枝果皮的水分逐渐减少，果皮开始暗淡，褐变加速，在贮藏16 d时，褪黑素处理组的荔枝水分蒸腾变缓，失重现象被有效遏制，果皮褐变速度减慢，能更好地维持细胞膜完整，有效抑制O2-的产生、MDA含量的上升和POD酶活性的升高，同时还提高果实抗氧化能力。其中褪黑素处理组的荔枝失重率比对照组低27.65%，褐变指数比对照组降低29.39%，相对电导率、O2-产生速率、MDA含量和POD酶活性分别比对照组低20.28%、19.65%、15.59%和14.77%。

与此同时，褪黑素处理的荔枝在贮藏过程中，果皮色泽维持的更好，花青素含量更稳定，CAT和SOD酶活性更高，自由基清除能力大大提高，有效减缓了活性氧对荔枝的损害，并维持荔枝果实较好的质地。在贮藏16 d时，褪黑素处理组的L*值、花青素含量、CAT活性和SOD活性分别比对照组高8.24%、75.00%、44.42%和23.46%。

相关性分析结果表明，荔枝的失重率、褐变指数、相对电导率、丙二醛含量、O2-产生速率、L*值、花青素含量等与贮藏时间有极其显著性的联系，能较好反映采后冷藏期间荔枝的品质。结合主成分分析结果可知，荔枝的品质可由2个主成分代表，在第1主成分中贡献率大小为失重率>褐变指数>L*值>相对电导率>花青素含量>O2-产生速率>丙二醛含量>PPO活性；而第2主成分中贡献率比较结果为CAT活性>SOD活性>POD活性，所以失重率、L*值、褐变指数和CAT活性是第1、第2主成分的关键指标，而褪黑素不仅能减缓失重率和褐变指数的上升，而且在保持果皮亮度（L*值）和提高CAT活性上有非常显著的效果，所以0.4 mmol/L褪黑素处理确实能有效保持荔枝采后贮藏期间的品质，延缓其衰老褐变。

综上，褪黑素处理荔枝能较好地保持其食用品质和外观品质，保持果实较好的生理特性，从而延长果实的贮藏期。