奶粉中香兰素甲基香兰素和乙基香兰素UPLC-MS/MS 法的不确定度评定

陈海南，周建峰

（温州市质量技术检测科学研究院，浙江温州 325000）

香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素是行业中重要的广谱型高档香料，是目前全球产量最大的香料之一，具有清甜的豆香、粉香气息，可用作定香剂、协调剂及调味剂，广泛应用于食品、饮料、化妆品、日用化学品及医药等行业[1-2]。作为天然香料，广泛存在与自然界中，甲基香兰素、乙基香兰素则是化学合成物质，3 种物质均有浓烈奶香味，具有增进食欲、提高食品品质、恢复食品香味、强化特征味道及消杀食品中不良味道的效果。

目前研究指出，过量食用香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素可以导致头晕、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至能够损伤肝、肾，对人体健康有较大危害[3]。在食用奶粉最大的婴儿群体中，研究数据显示过多食用添加香兰素等添加剂的奶粉后，会使婴儿对其产生依赖性，时间越长、吃得越多，小婴儿或将更易染上偏食、挑食、厌食等不良饮食习惯，使得摄入营养不全。

国家卫计委发布实施的GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[4]明确指出不得添加任何食用香料、香精有27 种食品，其中包括巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳、无水黄油、稀奶油和婴幼儿配方乳粉等多种乳制品，而且规定，0～6 个月的婴幼儿配方食品不得添加任何食品用香料，香兰素在婴幼儿谷类辅助食品中可以使用[5]，但最大使用量不得超过7 mg/100 g，美国食品香料与萃取物制造者协会（FEMA）建议软饮料中香兰素的用量为6.3 mg/100 g。国家企业信用信息公示系统显示，2020 年12 月，国家市场监督管理总局在单一批次雅培一款0～6 月龄1 段婴儿配方奶粉的抽检中检出极微量香兰素，香兰素项目实测值为171.6 μg/kg。经过调查，造成涉事批次产品香兰素不合格的原因是雅培集团爱尔兰工厂在生产线更换品种生产时，对生产管道清洗不彻底，致使生产管道中残留了前序产品含有的香兰素，造成涉事批次产品香兰素成分污染[6-7]。

目前，对香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素没有相应的国家检测标准和方法，只有地方标准《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定BJS 201705》[8]。国内对于该3 种香料的研究，也有许多研究已经涉及并开发检测方法，有对植物油中的香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的高效液相色谱串联质谱的测定[1]，有对于米粉中香兰素和乙基香兰素含量的测定[9]，有气相色谱法测定椰子汁或复原椰子汁中5 种香料等[10]。对于香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的含量测定[11-22]，除了必要的检测方法外，还需要关注测量结果的不确定度。现可查阅的文献只有一篇关于气相色谱质谱法测定奶粉中香兰素的不确定度评估[23]，且不涉及另外2 种香兰素香味剂。因此，依据CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[24]、JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》[25]、JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[26]和地方标准《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定BJS 201705》，研究了奶粉中的香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素含量的不确定进行测定和分析，为准确测定奶粉中香味剂含量提供更加科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶粉，市售；香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素标准品（纯度≥98.0%）；甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；甲酸，色谱纯；正己烷，色谱纯；氯化钠，分析纯；水为GB/T 6682 规定的一级水；孔滤膜（孔径为0.22 μm 有机相微孔滤膜），上海安谱公司提供。

1.2 仪器与设备

Agilent1290/6470 型三重四极杆液相色谱-串联质谱，配ESI 源，美国安捷伦公司产品；IKA MS3型涡旋振荡器，德国IKA 公司产品；SIGMA3K15 型冷冻离心机（转速≥5 000 r/min），美国Sigma 公司产品；Research Plus 型微量移液器，德国艾本德公司产品；Millipore 型超纯水处理系统，美国Millipore公司产品；SK5200H 型超声波清洗器，上海科导超声仪器公司产品；HCB1002 型分析天平，艾德姆衡器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

（1）标准储备液（1.00 mg/mL）。分别称取香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素0.1 g；（精确至0.000 1 g）标准物质于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。于-18 ℃下避光保存。

（2）混合标准储备溶液。分别吸取上述3 种标准储备液100 μL 于同一个100 mL 容量瓶中，用乙腈稀释到刻度配制成质量浓度为1.0 μg/mL 的混合标准储备溶液，于-18 ℃下避光保存。

（3）空白基质溶液。按照前处理方法操作制备空白基质溶液。

（4）基质混合标准系列工作液。分别准确吸取香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素混合标准储备液适量，用空白基质提取液将其稀释为10，20，40，80，160 ng/mL 标准系列工作溶液，临用时现配。

1.3.2 样品前处理

称取1 g 样品（精确至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯离心管中，加入3 mL 水，涡旋振荡30 s，加入7 mL 乙腈，涡旋振荡30 s，超声处理25 min，以转速10 000 r/min 离心5 min 后，取上层清液2 mL 于10 mL 玻璃离心管中，加入1 mL 正己烷，涡旋混合30 s，以转速5 000 r/min 离心3min 后，取下层清液，过滤膜（0.22 μm，有机相），待分析。

1.3.3 仪器分析参考条件

（1）液相部分设置。色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），美国安捷伦公司产品；液相流速0.3 mL/min；柱温箱温度30 ℃；进样体积2 μL；流动相A 为甲醇；流动相B 为含0.1%甲酸的水；程序洗脱条件为0～0.5 min，75% A；0.5～2.0 min，75%→50% A；2～6 min，50%A；6～7 min，50%→10% A；7～9 min，10% A；9～12 min，10%→75%。

（2）质谱部分设置。离子源：电喷雾离子源（ESI），扫描方式为正离子扫描（ESI+），检测方式为多反应监测（MRM）。

化合物的质谱参数见表1。

表1 化合物的质谱参数

1.3.4 不确定度数学模型的组建

待测组分含量计算：

式中：X——待测组分含量，μg/kg；

C——待测组分在标准曲线中所得溶液质量浓度，ng/mL；

V——定容体积，mL；

m——称量样品的质量，g。

2 结果与分析

2.1 分析检测过程不确定度的因素

分析整个测定过程，对奶粉中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素测量值的不确定度影响因素如下：样品称量Urel(A)，样品提取过程Urel(B)，标准物质的纯度Urel(C)，标准溶液称量稀释过程Urel(D)，标准工作曲线拟合Urel(E)，重复性测量Urel(F)，测量回收率Urel(G)，测量仪器Urel(H)。相对标准不确定度合成表示为：

2.2 不确定度因素的分析

2.2.1 样品称量产生的不确定度

检测方法使用百分之一的天平作为称量设备（艾德姆衡器电子天平HCB1002），检测方法中要求称取1 g 样品，称量天平由温州计量院检定，证书编号为（CA210105758），该证书提供的允许误差为±0.01 g，在分布均匀的条件下，=0.005 77，称量产生的相对标准不确定度为：=0.005 77。

2.2.2 样品提取过程产生的不确定度

该检测方法在提取过程中涉及的准确体积量为3 mL 水和7 mL 乙腈，最终定容体积可视为10.0 mL。检测过程使用10.0 mL 移液管，由温州计量院检定，证书编号为（CA210610218），最大允许误差为±0.05 mL。由移液管移取过程产生的相对不确定度为=0.003 849 1，=0.001 649 6。已知水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，乙腈的体积膨胀系数为1.4×10-3℃-1，测量实验室的温度为20±5 ℃，依据95%置信概率条件（k=1.96），在提取过程中温度影响产生的不确定度为：

由样品提取过程产生的相对标准不确定度为：

样品提取过程产生的不确定度：

2.2.3 标准物质纯度产生的不确定度

由香兰素标准物质证书可知，纯度为99.9%，当k=2 时在95%置信区间上扩展不确定度U=0.5%，则产生的相对标准不确定度为=0.002 50；而由甲基香兰素证书和乙基香兰素证书提供的纯度分别为99.4%和99.9%，当k=2 时在95%置信区间上扩展不确定度分别为U=2%和U=0.5%，可以得出产生的相对标准不确定度为：

2.2.4 标准物质配制稀释过程产生的不确定度

计算香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素标准物质配制稀释过程的不确定因素：

（3）三次配制，配制成香兰素标准物质系列曲线工作液。用200 μL 移液器分别移取10，20，40，80，160 μL，将1.0 μg/mL 香兰素标准物质中间工作液定容到1 mL 容量瓶里，并用空白基质定容，得到10，20，40，80，160 ng/mL 的系列标准物质工作液。200 μL 移液器需要使用5 次，1 mL 容量瓶使用5 次。依据JJG 646—2006《移液器 检定规程》[28]的要求，按矩形分布计算，则香兰素标准物质系列曲线工作液配制产生的相对标准不确定度为：

系列标准物质工作液配制产生的不确定度见表2。

表2 系列标准物质工作液配制产生的不确定度

通过3 次配制过程，产生的香兰素配制稀释过程的合成相对标准不确定度为：

由以上香兰素相对标准不确定度计算过程可以得出甲基香兰素和乙基香兰素的配制稀释过程产生的相对标准不确定度为Urel(D甲基香兰素)和Urel(D乙基香兰素)为0.022 068 58。

2.2.5 标准工作曲线拟合产生的不确定度

使用标准物质工作液10，20，40，80，160 ng/mL的各个质量浓度点，同一个质量浓度分别测定3 次，5 个浓度点计5×3=15 次，依据最小二乘法拟合标准曲线，得到3 种物质的3 条线性回归方程：Y=aX+b。对待测样品的重复测定次数为6 次，则拟合标准工作曲线产生的不确定度为：

式中：S——单一峰响应值的标准偏差；

a——拟合曲线斜率；

b——拟合曲线截距值；

n——拟合曲线时，标准浓度点的测定次数；

X——被测样品的浓度最佳估计值；

X——标准曲线各个浓度点的平均值；

Xi——标准曲线系列浓度点的值；

Y——标准曲线中各浓度点对应的峰面积响应值。

标准工作曲线点浓度-峰面积响应值对应表见表3。

表3 标准工作曲线点浓度-峰面积响应值对应表

后续得到曲线，5 个点计15 个质量浓度点测定数的峰面积响应值，代入公式得出香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素由标准工作曲线拟合产生的相对标准不确定度为：

2.2.6 重复性测量产生的不确定度

在相同的测量条件下，对6 份空白奶粉样品做600.0 μg/kg 水平的混合标准工作液添加测量试验，按照标准方法测定。

重复性测量结果和测量回收率见表4。

表4 重复性测量结果和测量回收率

依据贝塞尔（Besssel）公式，合成重复性测量的相对标准不确定度为：

式中：Xi——测量值；

S(Xi)——标准偏差；

n-1——自由度。

由表4 可计算出Urel(F香兰素)=0.012 798 40，Urel(F甲基香兰素)=0.013 123 36，Urel(F乙基香兰素)=0.022 175 51。

2.2.7 测量回收率产生的不确定度

依据2.2.6，在600.0 μg/kg 水平对6 份空白奶粉样品进行加标，按照标准方法测定，得到测量回收率结果。依据贝塞尔（Besssel）公式，合成测量回收率的相对标准不确定度为：

式中：ri——回收率值；

S(Ri)——标准偏差；

n-1——自由度。

由此可以由表格X 计算出Urel(G香兰素)=0.012 816 684，Urel(G甲基香兰素)=0.013 101 677，Urel(G乙基香兰素)=0.022 107 853。

2.2.8 测量仪器产生的不确定度

Agilent1290/6470 三重四极杆液相色谱-串联质谱的校准证书（CB201004144）提供的不确定度U=2%，k=2，按照正态分布，其产生的相对标准不确定度为Urel(H)=0.010。

2.3 合成标准不确定度因素的评定

2.3.1 合成总相对不确定度

由上述分析各个因素的相对不确定度公式，计算合成奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素含量测定结果的总相对不确定度。

香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的各因素相对不确定度见表5。

表5 香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的各因素相对不确定度

2.3.2 扩展不确定度和测定结果

测试试验结果，最后测试加标盲样，香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素测定含量为100.0 μg/kg，依据取包含因子k=2，置信概率为95%时，香兰素的扩展不确定度为Urel(X香兰素)=C×k×Urel=100.0×2×0.035 57=7.1 μg/kg；甲基香兰素的扩展不确定度为Urel(Y甲基香兰素)=C×k×Urel=100.0×2×0.037 91=7.6 μg/kg；乙基香兰素的扩展不确定度为Urel(Z乙基香兰素)=C×k×Urel=100.0×2×0.042 16=8.4 μg/kg。由上述可得出，奶粉中香兰素的含量表示为100.0±7.1 μg/kg，甲基香兰素的含量表示为100.0±7.6 μg/kg，乙基香兰素的含量表示为100.0±8.4 μg/kg，k=2。

4 结论

测试依据检测方法对不确定因素的来源展开分析并对各分因素不确定度进行具体计算，由表5 可知，标准溶液称量稀释过程产生的相对标准不确定度为第一影响因素，其次是标准工作曲线拟合、重复性测量和测量回收率产生的相对标准不确定度，其余的样品称量、样品提取过程、标准物质的纯度及测量仪器产生的相对标准不确定度均比较低。为了提高测定结果的准确性，应该在系统误差恒定的情况下，尽可能地在配制曲线上下重心，配制合适范围的线性曲线，在实际检测过程中，通过选择稳定的标准物质，增加校准标准物质的测试步骤，并对样品进行平行测定，定时对天平设备和检测设备进行维护校准，减少过程中的不确定度，并加强检测人员的试验操作规范化和熟练度。