蜡样芽孢杆菌的抗逆性研究

张海艳，刘 芳，姜旭芳

（洛阳师范学院 生命科学学院，河南 洛阳 471934）

蜡样芽孢杆菌属芽孢杆菌科、芽孢杆菌属[1]，是兼性需氧性革兰氏阳性菌[2]。蜡样芽孢杆菌产生芽孢时对高温、高酸和高碱产生很强的抗逆性，对部分抗生素产生一定的耐受性[3]。抗生素的过量使用及畜牧产品药物残留对环境的污染，导致越来越多的细菌对抗生素产生了耐药性，如何利用生物防治避免化学防治的弊端成为当今的热点问题之一[4]，无毒、无害的微生态制剂（将有益微生物经鉴定、筛选、发酵培养等制成的一种活菌制剂[5]）逐渐被大量研究。目前大多数益生菌抗逆性差，耐高温及酸碱的能力弱，添加在饲料中无法保证产品的有效性。芽孢杆菌能产生芽孢，抗逆性强，可弥补益生菌的不足，抗性及产孢条件是芽孢杆菌研究的热点[6]。无毒的蜡样芽孢杆菌是一种对宿主有益的益生菌，生长繁殖过程中产生的大量营养物质，通过改善肠道微生态环境、增强机体免疫力防治疾病、促进动物生长发育[7-8]，利用自身产生的抗菌物质杀死细菌，不会使细菌产生耐受性，不会给环境带来毒害残留物，减轻了环境污染。蜡样芽孢杆菌耐高温、耐高酸、耐高碱，能够提高饲料转化率及利用率，是一种理想的动物饲料添加剂，同时在人体保健医疗、植物生长促进剂等领域的应用潜力较大[9]。

微生态制剂的应用要考虑菌株能否通过胃酸的消化，饲料加工时高温能否杀死菌株及菌株产生最佳作用效果的培养条件。本研究基于以上问题，探究了蜡样芽孢杆菌的生长特性、耐酸碱性、耐高温性、对抗生素的耐受性及实现最大生物产量的培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：蜡样芽孢杆菌由洛阳师范学院生命科学院动物营养与健康研究室提供。培养基：LB固体培养基、LB液体培养基，参照文献配制[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 将冷藏保存的蜡样芽孢杆菌用接种环在LB固体培养基表面划线，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，挑取单个菌落到LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min摇床培养12 h。

1.2.2 种子液制备 吸取1 ml菌液，12 000 r/min离心2 min，弃上清液，加1 ml PBS摇匀后离心2 min，弃上清液，加1 ml PBS摇匀后，用酶标仪测OD值，以OD600值=0.5的菌液为种子液。

1.2.3 生长曲线绘制 取种子液以1%的量接种至LB液体培养基中，在37 ℃、转速220 r/min的摇床中培养8 h后测OD600值，之后每隔4小时吸取1 ml菌液测OD600值，绘制菌种生长曲线。

1.2.4 活菌及芽孢测定方法 活菌：倾注法活菌计数[12]。芽孢：培养菌液80 ℃水浴加热10 min，充分灭活营养体菌体细胞后以倾注法进行活菌计数[13]。

2 结果与分析

2.1 生长曲线

0～16 h蜡样芽孢杆菌生长较快，以对数的方式增值；16～24 h菌株新增和死亡达到平衡，蜡样芽孢杆菌生长基本进入稳定期；24 h后蜡样芽孢杆菌进入衰亡期，培养基中的营养物质及氧气消耗导致菌株消亡，菌株数不断减少（图1）。

图1 蜡样芽孢杆菌生长曲线

2.2 温度对活菌数和存活率的影响

随着温度的升高，活菌数逐渐下降，但蜡样芽孢杆菌的存活率较高，以37 ℃为空白对照，在90 ℃和100 ℃的高温下处理10 min，存活率分别达83.7%和83.4%，说明蜡样芽孢杆菌耐高温（图2）。

图2 温度对活菌数和存活率的影响

2.3 pH对活菌数和存活率的影响

以pH=7为空白对照，pH值分别为2、9时，蜡样芽孢杆菌的存活率均在80%以上，说明蜡样芽孢杆菌耐酸碱（图3）。动物胃肠道的pH值为2～3，小肠的pH值为5～7，动物饲料的pH值为6.2～6.8，均对蜡样芽孢杆菌的生长影响不大。

图3 pH对蜡样芽孢杆菌活菌数和存活率的影响

2.4 培养时间对蜡样芽孢杆菌生长和产孢率的影响

活菌数和芽孢数都随培养时间先增加后减少，且都在24 h达到最佳，此时产孢率为93.1%，所以24 h为蜡样芽孢杆菌的最佳培养时间（图4）。

图4 培养时间对蜡样芽孢杆菌 生长和产孢率的影响

2.5 初始pH值对蜡样芽孢杆菌生长和产孢率的影响

初始pH=7.5时，蜡样芽孢杆菌活菌数最多，但此时芽孢数不是最多；初始pH=6.5时，芽孢数最多且产孢率最高（图5）。因此，最佳初始pH值为6.5。

图5 初始pH值对蜡样芽孢杆菌 生长和产孢率的影响

2.6 装液量对蜡样芽孢杆菌生长和产孢率的影响

蜡样芽孢杆菌为好氧菌，装液量少时通气量大、氧气含量高，有利于菌株生长和芽孢形成。装液量为25 ml时活菌数、芽孢数和产孢率均达到最大，因此装液量以25 ml为最佳（图6）。

图6 装液量对蜡样芽孢杆菌生长和产孢率的影响

2.7 蜡样芽孢杆菌对抗生素的耐受性

由表1可知，蜡样芽孢杆菌对赤霉素有高浓度的耐受性，对硫酸卡那霉素和硫酸链霉素有低浓度的耐受性。在饲料中添加上述抗生素不会抑制菌株的作用效果。

表1 蜡样芽孢杆菌对抗生素的耐受性

3 结论与讨论

蜡样芽孢杆菌具有很好的抗逆性，对赤霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素均具有一定的耐受性，其最佳产孢条件为培养温度37 ℃、培养时间24 h、初始pH值6.5、装液量25 ml；蜡样芽孢杆菌可作为生物制剂添加在动物饲料中。

蜡样芽孢杆菌作为微生态制剂应用十分广泛，作为饲料添加剂改变了凡纳滨对虾肠道微生物的组成，提高了对虾的生长速度[14]。刘一尘等[15]认为蜡样芽孢杆菌能够促进动物消化吸收，提高饲料转化率及利用率。陈旭东等[16]研究发现，蜡样芽孢杆菌能产生细菌素和拮抗致病菌。虽然强调以活的菌种添加在动物饲料中，但实际应用中多为芽孢杆菌的死菌，目前死菌与活菌的作用效果是否一致，不同微生物制剂的添加量是否会引起不同的效果，模拟酸度与动物胃酸的效果是否一致等问题仍需进一步研究和探讨。