小鼠炎症性肠病合并艰难梭菌感染模型的建立与评价

王 莉，周芬芬，胥 腾，吴 湜，李静文，黄海辉

艰难梭菌是引起医院获得性腹泻的重要病原体，也是炎症性肠病（IBD）加重或反复的危险因素。多项研究显示IBD亦是艰难梭菌感染（CDI）的一项独立危险因素[1]。近年来，IBD合并CDI的发病率上升，病情严重，急性结肠切除率和死亡率均增高[2-3]。然而，IBD患者合并CDI发病机制尚不明确，构建能反映疾病特点的动物模型对进一步研究十分必要。

最初国外研究者采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导小鼠结肠炎，继而腹腔注射克林霉素以诱导CDI来建立IBD急性期合并CDI模型[4]。由于部分IBD患者是在缓解期出现CDI[5-6]，因而又有研究者先通过给予小鼠DSS诱导结肠炎，之后小鼠度过一段恢复期，然后再给小鼠饮用抗生素混合液及腹腔注射克林霉素以诱导CDI来建立IBD合并CDI模型[5]。然而由于头孢哌酮抗菌谱广，安全性好，因此近年来临床上IBD患者应用克林霉素的机率远低于头孢哌酮，既往很多动物研究也显示头孢哌酮的干预有利于艰难梭菌的定植[7-9]。但是头孢哌酮腹腔注射给药对诱导小鼠艰难梭菌定植特点未见报道，为此，本研究拟分别采用腹腔注射克林霉素或头孢哌酮诱导CDI，以探索建立更符合临床过程的IBD急性期和恢复期小鼠合并CDI模型的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株和细胞 艰难梭菌菌株SW2007H1（核糖体型027菌株），由瑞典卡罗林斯卡医学院惠赠。Vero 细胞（目录号：SCSP-520）购自中国科学院细胞库，用于粪便毒素检测实验。

1.1.2 实验动物 野生型C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，16～19 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国科学院上海巴斯德研究所ASBL2动物房。所有实验与操作均符合动物伦理规范与要求（伦理批号：2020069）。

1.1.3 抗菌药物 克林霉素、头孢哌酮等抗菌药物均购于大连美仑生物科技有限公司。抗菌药物混合液由45 mg/L万古霉素、35 mg/L黏菌素、 35 mg/L庆大霉素和215 mg/L甲硝唑溶于无菌水中，0.22 μm过滤后备用。

1.1.4 主要试剂和培养基 DSS为美国MP Biomedicals公司产品。心脑浸液琼脂及肉汤、酵母提取物为英国OXOID公司产品。

1.2 方法

1.2.1 艰难梭菌芽孢制备 将1株艰难梭菌（核糖核酸型027）从－80℃冰箱取出，接种于含添加剂的心脑浸液（BHIS）平板上，厌氧培养48 h后，挑取单菌落至BHIS肉汤中，过夜增菌，将菌液涂布于BHIS平板上。厌氧培养约1周后，显微镜下观察菌体全部变为芽孢后，6 000 r/min离心10 min，留取沉淀，用无菌PBS洗涤2～3次，用PBS重悬，65℃加热30 min以杀死营养细胞。将菌液10倍系列稀释涂布于BHIS平板上，进行芽孢计数，制备106CFU/mL的芽孢悬液，4℃保存。

1.2.2 模型建立与分组 将小鼠分为IBD急性期合并CDI和IBD恢复期合并CDI 2大组，每个大组再根据腹腔注射克林霉素或头孢哌酮分为2小组，共4组，每组8只鼠，另设1组健康对照组，不作任何处理。所有时间计算都以24 h计。IBD急性期合并CDI组先给予3%DSS饮用水5 d（Day0～Day5），后换成正常饮用水，于第6天分别腹腔注射1剂10 mg/kg克林霉素或100 mg/kg头孢哌酮，于第7天每只小鼠灌胃105CFU艰难梭菌芽孢（即100 μL 含 106CFU/mL芽孢PBS混悬液）；IBD恢复期合并CDI组先给予2%DSS饮用水6 d （Day0～Day6），后换成正常饮用水15 d，再给抗生素混合液3 d（Day21～Day24），再改为正常饮用水，于第26天分别腹腔注射1剂10 mg/kg 克林霉素或100 mg/kg头孢哌酮，于第27天每只小鼠灌胃105CFU艰难梭菌芽孢（即100 μL 含 106CFU/mL芽孢PBS混悬液）。上述各组小鼠均观察至第34天，小鼠处于濒死状态将被处死[4]，感染组实验设计见图1。

1.2.3 观察指标 ①小鼠的体重变化。②小鼠疾病活动度指数（disease activity index，DAI）评分[4]：根据体重，将下降＜5%、5%～10%、11%～15%、16%～20%、＞20%依次评为0、1、2、3、4分；粪便性状为成形、柔软、腹泻、中度腹泻和全腹泻，分别评为0、1、2、3、4分；根据便血程度评分，无便血为0分，微红色为2分，血便为3分，全血便为4分；总分为12分。③小鼠生存率：体重下降＞初始体重20%认定为濒死状态，将被处死，与实际死亡的小鼠共同计算死亡率。④病理观察：小鼠疾病高峰期时取结肠做病理分析，采用4%多聚甲醛固定、切片、HE染色。根据炎症程度、隐窝破坏和溃疡情况3方面评分，共11分[4]。

1.2.4 检测粪便中细胞毒素 给予艰难梭菌灌胃48 h后（Day2或Day3），收集小鼠粪便。将收集的小鼠粪便或肠道内容物样本溶于10倍质量体积的无菌PBS中混匀后，4℃ 15 000 r/min 离心 5 min，取上清液作系列稀释，加入至单层Vero细胞中，放置在5% CO2孵箱中，37℃培养，观察若超过80%细胞变圆则为毒素阳性[10]。若粪便毒素阳性且小鼠出现相应艰难梭菌感染症状，如弓背、体重下降、腹泻等症状，则表明感染成功。

1.2.5 菌株鉴定 粪便样本采用Cepheid公司的Xpert™C. difficileAssay 艰难梭菌核酸检测试剂盒验证是否为tcdC基因突变艰难梭菌，如检测阳性则提示致病菌为027型可能大。

1.2.6 统计学方法 采用GraphPad 8.0进行所有数据的统计分析，采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，实验数据用均数±标准误差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功建立小鼠IBD合并CDI模型

4组小鼠均出现腹泻和体重下降症状，同时粪便毒素检测阳性，粪便艰难梭菌tcdC突变阳性，病理显示结肠出现炎性渗出、隐窝破坏和局灶溃疡，因此建模成功。

2.2 小鼠体重变化和DAI评分

2.2.1 急性期组 在感染艰难梭菌后，克林霉素组和头孢哌酮组小鼠均出现体重下降，其中克林霉素组在感染艰难梭菌第3天体重下降最严重，后呈回升趋势，头孢哌酮组主要在第1、2天体重下降，后迅速恢复。克林霉素组体重下降程度较头孢哌酮组更为明显，体重回升相对较慢。克林霉素组小鼠DAI评分在感染后第3天最高，头孢哌酮组在第1、2天较高，感染后克林霉素组小鼠DAI评分均高于头孢哌酮组，自第3天起两组DAI评分差异有统计学意义，见图2A、2B。

2.2.2 恢复期组 在感染前，因给小鼠饮用DSS水溶液诱导轻中度腹泻，小鼠于第8、9天体重下降最为明显，后逐渐回升至正常水平，克林霉素组和头孢哌酮组体重变化相似。在感染后，克林霉素组体重逐渐下降，至第3天下降至最低并全部死亡，头孢哌酮组于第1、2天下降明显但程度较轻，第3天迅速回升。克林霉素组体重下降程度较头孢哌酮组更为明显。克林霉素组DAI评分较头孢哌酮组为高，在第2、3天差异有统计学意义，头孢哌酮组DAI评分于第4天降低至近0，见图2C和2D。

2.3 小鼠生存率

2.3.1 急性期组 克林霉素组小鼠生存率为25.0%（2/8），死亡主要集中在艰难梭菌芽孢感染后第2、3天，与对照组生存率有显著差异。头孢哌酮组小鼠生存率为62.5%（5/8），死亡主要集中在感染后第1、2天，但与对照组差异无统计学意义，见图3A。

2.3.2 恢复期组 在感染后，克林霉素组小鼠在第2、3天相继全部死亡。头孢哌酮组小鼠只在第2天出现1只死亡，生存率为87.5%（7/8），生存率明显高于克林霉素组，差异显著，但与对照组差异无统计学意义，见图3B。

2.4 小鼠组织病理学变化

与健康对照组相比，4组感染组小鼠结肠均出现不同程度的炎性渗出。急性期克林霉素组出现炎性细胞向黏膜下层浸润，隐窝破坏严重，并出现溃疡，而急性期头孢哌酮组炎性浸润和隐窝破坏较前者为轻。恢复期克林霉素组也同样出现了炎性细胞的广泛浸润，隐窝破坏严重甚至消失，伴有局灶性溃疡，而恢复期头孢哌酮组病理改变相对轻微。与健康对照组相比，急性期克林霉素组和头孢哌酮组组织评分分别为7.33±0.29和5.33±2.02，恢复期克林霉素组和头孢哌酮组评分分别为7.67±0.29和4.67±1.61，4组差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

IBD被认为是由多种因素引起的黏膜免疫反应紊乱和肠道菌群失调的一种慢性肠道炎症。艰难梭菌在宿主菌群受到破坏的情况下，产毒素菌株通过分泌毒素破坏肠道屏障，引起以腹泻为主的一系列症状[11]。IBD患者对艰难梭菌的易感与IBD病情严重程度有关[12]。因而建立不同疾病阶段的IBD合并CDI动物模型是研究二者相互作用及机制的重要平台，为探索新的防治方案提供 参考。

很多研究采用腹腔注射克林霉素的方法建立CDI动物模型[13-14]。Tomkovich等[15]的研究显示克林霉素干预后，小鼠的肠道菌群发生明显变化，比如毛螺菌科、瘤胃菌科、肠杆菌科细菌丰度改变，艰难梭菌易定植。同时，也有研究通过给予小鼠饮用头孢哌酮水溶液成功诱导CDI[8]。Theriot等[7]的研究显示小鼠饮用头孢哌酮水溶液后，肠道微生物组和代谢组也发生了明显的变化，比如拟杆菌科细菌明显减少，变形菌门细菌明显增多；代谢物初级胆汁酸、糖醇增多，次级胆汁酸、葡萄糖、游离脂肪酸减少，为艰难梭菌易感状态。此外，有研究对比了抗生素鸡尾酒疗法联合腹腔注射克林霉素、头孢哌酮水溶液饮用5 d和10 d 3种不同抗生素给药方法诱导CDI，均成功建立了CDI模型[10]。但上述方法头孢哌酮的干预方式均为配制成水溶液供小鼠自由饮用数日，但未见头孢哌酮腹腔注射对小鼠艰难梭菌定植的影响。近年Zhou等[4]的研究首次发现DSS诱导的结肠炎小鼠感染艰难梭菌时，临床结局较IBD和CDI单病种小鼠更差，同时IBD小鼠在有抗生素使用史的情况下，腹腔注射克林霉素后更易感染艰难梭菌。本研究对比了IBD急性期小鼠分别腹腔注射克林霉素和头孢哌酮后的相关表型，发现克林霉素诱导CDI的小鼠疾病严重程度较头孢哌酮组为重，且恢复相对较慢，更符合IBD合并CDI疾病较重的特点，也与Zhou等[4]的研究一致。Saleh等[5]研究在DSS撤去15 d后，再对小鼠按照建立CDI模型的方法给药，该模型可更好反映临床上IBD患者缓解期的表现。本研究同样对比了IBD恢复期小鼠分别注射克林霉素和头孢哌酮对诱导CDI的影响，结果显示克林霉素诱导的小鼠疾病较重，死亡率100%，与Saleh等[5]的研究一致，而头孢哌酮诱导的小鼠病情轻微，可能无法模拟IBD合并CDI患者情况。本研究发现IBD急性期和恢复期的小鼠感染艰难梭菌后，疾病变化过程类似，如急性期和恢复期IBD小鼠采用克林霉素诱导合并CDI时，在感染艰难梭菌后第3天疾病最为严重。不同的是，克林霉素诱导的恢复期组模型较急性期组病情更为严重，生存率更低，有研究认为这可能是结肠炎诱导产生T辅助17细胞，这些细胞在结肠炎恢复后仍存在于肠系膜淋巴结中，并在之后CDI时发挥作用，加重病情[5]。

本研究存在一定局限性：采用化学法DSS诱导结肠炎，只能模拟IBD中溃疡性结肠炎的疾病特点，不适用于克罗恩病[16]；未对不同模型小鼠肠道菌群及代谢产物进一步分析，做机制上的 探索。

综上所述，相较于头孢哌酮，采用腹腔注射克林霉素的方法建立IBD急性期和恢复期小鼠合并CDI模型更为严重，生存率更低，因而推荐采用10 mg/kg的克林霉素腹腔注射诱导建立急性期或恢复期IBD小鼠感染艰难梭菌的模型，可反映临床上处于不同阶段的IBD合并CDI患者的特点。