非疫苗血清型多重耐药肺炎链球菌的研究现状及展望

李亚楠，司明辉，张文双

近年来由于耐药基因传播模式及血清型替换导致的群体结构改变，非疫苗血清型（NVT）多重耐药肺炎链球菌（MRSP）的出现在国际公共卫生和临床环境中引起了极大的关注。肺炎链球菌感染至今仍是5岁以下儿童死亡的重要原因，每年达70万～100万，其中多数在发展中国家。据WHO报道，尽管至今未出现对万古霉素耐药的肺炎链球菌，侵袭性感染的病死率仍高达10%～40%[1]。20世纪以来，根据血清型流行概况研制出可覆盖多种血清型的肺炎链球菌结合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine，PCV）：PCV7、PCV10、PCV13等，大大降低了侵袭性肺炎链球菌疾病（invasive pneumococcal diseases，IPD）的发生率[2]。2010年PCV13在美国应用后，侵袭性肺炎链球菌临床分离株只有1/4为疫苗覆盖血清型，大部分感染为NVT，尤其在血液肿瘤等免疫功能低下和脓毒症的患者。在一项荟萃分析中发现已经将PCV13纳入免疫规划的国家，42.2%的儿童IPD病例由非PCV13血清型引起，尤其是在欧洲和北美，说明NVT的增加在逐渐抵消PCV的作用[3]。但我国的PCV接种并未纳入免疫规划，且肺炎链球菌疾病的监测系统尚不完善，仅能了解区域性的流行概况。2020年CHINET细菌耐药性监测网的结果显示上海地区儿童患者中分离的耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）菌株中，96.2%对红霉素耐药，对克林霉素耐药率达到92.3%，对甲氧苄啶-磺胺甲唑全部耐药，致死率在2007—2015年也在增加。我国对NVT肺炎链球菌的耐药性研究较少，但在国外却频频出现在疫苗接种后由于重组事件等造成的NVT MRSP感染疾病的增加。本文就近5年对NVT MRSP的研究现状进行综述及展望，以便为我国血清型流行病学的监测、临床医师的经验性用药、免疫策略的开发与应用提供参考思路。

1 引入PCV后MRSP血清型流行现状

1.1 国外MRSP血清型流行现状

PCV已经被100多个国家纳入免疫规划，在引入后的20年间对菌株血清型及耐药性监测，发现NVT逐渐占据优势，成为引入疫苗后的研究热点，现着重介绍PCV13应用后最常见NVT 11A和15A MRSP菌株的耐药现状。

NVT 11A是鼻咽部肺炎链球菌分离株最普遍的血清型之一，Baek等[4]发现其在PCV引入后的8年间从3.2%增加到13.2%，在收集到的1 579株肺炎链球菌分离株中，发现多重耐药甚至广泛耐药（XDR）的菌株，超过60%的11A菌株对头孢呋辛、克林霉素和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药，多位点序列分型鉴定出2个主要克隆复合群CC166和CC99，其中多重耐药克隆群CC166的ST8279、ST9875和ST3598菌株对该研究检测的所有抗菌药物均不敏感。

最常见的MRSP NVT为15A-ST63，各个国家的分布不同。见表1。在加拿大观察到成人肺炎链球菌疾病中NVT 22F、15A和8在最流行的血清型排序分别为第1、第5和第7种，全基因组测序发现血清型15A均为多重耐药菌株[5]；在之前的报道中就已发现该血清型分离株对青霉素、克拉霉素和多西环素具有耐药性[6]。英国公共卫生部及抗菌化疗协会在对抗生素使用的监测中发现NVT 15A在2011年明显增加，在15A导致的IPD中，分离株中有26%～33%是三重耐药，即大环内酯类、四环素类和青霉素类耐药，2013—2015年监测显示15A是最流行的血清型，其中38%～48%具有三重耐药性，且几乎所有的多重耐药15A菌株经多位点序列分型均属于ST63[7]。近期在挪威的一项报道中显示接种PCV13期间，多重耐药分离株引起的IPD发病率从2004年的0.11/10万上升到2016年的0.38/10万，而这种增加 是 由 于NVT 15A （ST63）、24F（ST162）、23B（ST2372）和33F引起，其中血清型15A是多重耐药IPD增加的主要驱动力，经基因分型后发现几乎所有的15A多重耐药分离株均属于ST63，自2008年以来，该克隆流行率越来越高，覆盖了多重耐药分离株的52%[8]；2019年冰岛一项对照试验显示MRSP菌株自PCV10引入后从34.4%下降至23.9%，87.9%的PRSP菌株是多重耐药，但在疫苗接种后4年减少到72.9%，NVT多重耐药菌株 6C、15A却分别从0.9%、0.9%上升至16.4%、9.1%[9-10]；相似地，保加利亚也报告了NVT 6C和15A同样的耐药现况[11-12]。2014年西班牙的一项耐药监测分析中也显示与2006年相比，2012年的多重耐药率增加，主要是由于NVT相关的克隆复合群的出现或增加，如表现为8、15A和19A血清型的CC63、19A/CC320、23A/CC42[13]，提示血清型替换已经成为疫苗接种后的“常驻”现象。

表1 不同国家/地区耐多药15A-ST63对临床常用抗菌药物的耐药率

2015年Ozawa等[14]在分析PCV7对日本儿童急性中耳炎的影响时，发现NVT 15A造成的高患病率成为难治性中耳炎的重要危险因素，常出现于1岁以下的婴儿，并成为继19A之后的第二大血清型，且均为多重耐药。随后Naito等[15]也发现血清型6C、15A、15C和19A增加，多药耐药克隆在疫苗引入前期（Spain6B-2/ST90、Taiwan19F-14/ST236）下降，而Sweden15A-25/ST63是疫苗后期的优势克隆。PCV13在2010年引入韩国后，儿童的接种率＞95%，成人接种率约为15%，而在中国，PCV并未纳入免疫规划，接种率不到1%，2019年亚洲一项多中心研究调查显示韩国和中国MRSP的比例约50.8%，远高于世界其他地区的报告，如美国的21.8%[16]，特别是19F和19A的分离株中，多重耐药比例相对较高，在其他研究中发现了15A、15B、35B和23A血清型等也有类似趋势[17-21]； 2021年韩国在近10年间耐药监测中也发现，由非PCV13血清型引起的感染以及由NVT MRSP引起的IPD的比例增加，肺炎链球菌多重耐药率在近10年由0.9%上升至25.5%，成为亟待解决的“热点”问题[22]。

1.2 国内MRSP血清型的流行现状

我国香港、台湾是最先将PCV纳入“国家免疫计划”的地区。自2013年引入PCV13，2020年Wu等[23]对PCV引入前后抗生素敏感性进行分析时发现尽管血清型19A在后PCV7/前PCV13期间仍占领主导地位，但NVT 15A和23A已超过19A，成为2018年的前两个主要血清型，且新出现的血清型15A和23A均为多重耐药，对β内酰胺类药物和几种非β内酰胺类药物的耐药性均较高。而我国内地缺乏肺炎链球菌的监测机制，非NVT MRSP的研究较少，缺乏相应的数据。

2 NVT肺炎链球菌多重耐药的影响因素

2019年全球肺炎链球菌测序计划启动后，全基因组测序能够进一步了解NVT肺炎链球菌对抗生素耐药的机制，如利用基因的重组比来预测抗生素的耐药性，重组比越高，抗生素耐药性的平均类别数越高；利用基因组聚集成谱系定义全球肺炎链球菌序列簇GPSC并构建抗生素图，更有助于了解肺炎链球菌血清型与耐药性地理区域传播的背景[24]。国内对于NVT肺炎链球菌流行病学曾有描述，耐药性却很少涉及，现根据国内外研究现状总结如下。

2.1 抗生素的广泛应用

菌株可通过抗生素的选择性压力突变而产生耐药性[1，25-27]。2003年Ruhe等[28]应用多元logistic分析证实既往抗生素的使用是青霉素不敏感肺炎链球菌（PNSP）感染的预测因素，此项研究比较全面，在出现感染症状前1个月和6个月使用β内酰胺类、磺胺类和大环内酯类抗菌药物与PNSP菌血症相关，即短期和长期使用β内酰胺类都可以显著增加PNSP感染的风险，暴露在不同的抗菌药物种类及时间的长短均可引起不同程度的抗菌药物耐药，成为耐药性产生的独立危险因素。肺炎链球菌产生耐药性会造成难治性中耳炎、脑膜炎治疗失败，尤其是NVT MRSP的感染，PCV预防失败的情况下，最终可能会导致无药可用的不利境况。有研究报道称，日本某些地区出现耐美罗培南的多重耐药菌株15A-ST63，这与当地门诊广泛大量应用广谱抗生素有关，抗生素的不合理应用可能提供选择性压力从而使多重耐药菌株传播[29]。在2020年的中国肺炎链球菌感染诊疗及预防共识中，指出血清型可能是肺炎链球菌脑膜炎严重程度的重要决定因素，尤其在1月龄以上婴儿及儿童中，不得不考虑在疫苗防治失败、耐药菌株存在、万古霉素渗透脑脊液范围有限的情况下，如何早期经验性用药，以避免延误治疗而导致严重的并发症甚至死亡[1，30]。

2.2 基因的水平转移

Janoir等[31]分别对PCV7引入后期及PCV13引入后期IPD中分离出的肺炎链球菌菌株进行耐药表型的研究，发现NVT 12F、24F、15A和35B始终与1种或多种抗生素的耐药性相关，但15A和35B菌株的耐药率在两个时期并未发生变化，证明这些NVT的增加可能并不仅仅是由抗生素压力驱动。肺炎链球菌是一种高度重组病原体，可通过摄取和整合来自其他肺炎球菌菌株和其他相关非致病性缓解组物种的DNA而自然转化。Arushothy等[32]在对1例死于感染的20月龄患者血液标本中分离出的血清型15A-ST1591肺炎链球菌菌株的研究中发现，该菌株对红霉素、甲氧苄啶-磺胺甲唑、四环素、氯霉素、青霉素、头孢曲松和头孢噻肟均耐药，该克隆与CC81克隆复合群相关，且在扫描电镜中观察到19A（ATCC 700673）和血清型15A（SS40_16）之间可能存在水平基因转移，这是第一个血清型之间基因转移的可能性和效果的证据，他们之间共享的脂多糖基质赋予了高抗性的表型特征。日本在2012—2014年对收集的全国儿童NVT 15A的肺炎链球菌进行全基因组测序，发现了15A-CC63的新克隆ST9084，该克隆对大环内酯类、青霉素、头孢噻肟和美罗培南耐药，原因是在青霉素结合蛋白PBP2x区域发生了重组，导致了额外的头孢噻肟耐药，且该类菌株pbp1a、pbp2b和pbp2x的保守氨基酸序列与血清型19A-ST320的相同[33]；另1项葡萄牙的研究使用肺炎链球菌定植和感染小鼠模型，结合分离自已接种PCV7的儿童鼻咽部多重耐药肺炎链球菌的全基因组测序结果分析发现，多重耐药15A-ST63是19F克隆G54的荚膜转换产物[34]；Nakano等[35]在追溯可以促进美罗培南耐药的血清型15A-ST63中pbp1a-13序列的来源时发现，44.5%的血清型19A分离株检测到pbp1a-13，提示19A-CC3111克隆可能是PBP1a的主要存储库，pbp1a区可能在不同血清型菌株之间水平转移，但pbp1a-13单独存在时可能只导致青霉素耐药性，pbp2b或pbp2x区域的青霉素结合蛋白（PBP）重组并与pbp1a-13结合导致多重耐药，再次证明了血清型之间的水平基因转移可导致多重耐药。近期Savinova等[36]研究了1种由血清型19A荚膜转换产生的耐多药NVT 15A菌株，以血清型15A-ST14599（Sp1994）做参考，进行了全基因组测序及单核苷酸多态性系统发育分析，将不同序列类型的15A与19A基因组进行比较，结果显示Sp1994与所检测的19A-ST276基因组亲缘关系更相近，表明了二者之间密切的系统发育关系，证明15A分离株在转换过程中获得了cps基因座而产生了具有多重耐药表型的重组体。肺炎链球菌的高重组率促进了血清型的转换及耐药基因的获得及传播，自全球肺炎链球菌测序计划开展以来，英国公共卫生部建议可以利用肺炎链球菌全基因组测序来确定血清型与抗生素敏感性的关系[24]，这一举措有利于观察菌株血清型转换的发生及耐药性的变化，为临床合理性选择和用药提供了指导性意见。

2.3 疫苗的接种

2018年Obolski等[37]通过构建血清型和抗生素耐药性变化的理论框架，说明了接种疫苗可以消除疫苗血清型与NVT的竞争，从而导致先前存在的NVT耐药变异体的频率快速增加，即耐药性增加。因此避免PCV对肺炎链球菌血清型的选择压力显得至关重要，但由于目前PCV对耐药性的研究有限，仍需进一步深究。

3 结语与展望

综上所述，肺炎链球菌感染仍是一个重大的公共卫生危害。尽管随着地域不同，受到PCV的影响不同，但引入疫苗后NVT MRSP菌株的传播逐渐成为一种流行趋势，目前的疫苗仍是以肺炎链球菌荚膜多糖为抗原，成本较高且血清型覆盖类型有限，因此需要开发新的持久保护、适应性更强、成本更低的防治策略。近年来随着基因组技术的发展，肺炎链球菌毒力因子的研究成为热点，以此作为基础研发独立于血清型的疫苗层出不穷，如利用肺炎链球菌TIGR4裂解液制备的多抗原疫苗（MAV）[38]，全细胞肺炎链球菌疫苗（WCV）[39]，PspA重组抗原疫苗[40]等；在治疗方面，Liakopoulos等[41]用棋盘法和纸片扩散法药敏试验证实了Mn复合物[Mn（CO）3（tpa-κ3N）]Br对临床相关肺炎链球菌具有体内外抗菌活性，并有可能与现有抗生素联合使用，提高对MRSP的有效性，但均缺乏临床试验。因此，针对肺炎链球菌疫苗后血清型转换及多重耐药等诸多问题需给予高度重视，预防及治疗肺炎链球菌感染有待开拓新思路。