不同树龄榆树根围AM真菌与土壤因子相关性1)

张月欣 李钢铁 李俊杰 胡博

(内蒙古农业大学,呼和浩特，010000)

榆树(UlmuspumilaL.)为榆科属落叶乔木，又名榆、春榆、白榆、家榆、榆钱等，分布于中国、朝鲜、苏联、蒙古等地[1]。榆树是我国科尔沁沙地主要建群种，其因根系发达、枝叶繁茂、寿命长、具有耐贫瘠、耐寒抗旱、抗病性强等特点，是干旱半干旱沙区造林的理想树种[2]。沙地榆树疏林是科尔沁沙地天然沙生植物的顶级群落[3]，也被认为是最稳定的植被类型，不仅在保护环境、涵养水源、防风固沙等方面发挥着重要的作用，同时具有很强的适应性、稳定性、抗干旱能力和恢复能力[4]。

丛枝菌根真菌(AM)是一类能与陆地80%的植物形成互惠共生体的微生物[5]，在自然界中分布极其广泛。AM真菌侵染植物后形成的菌丝大大地增加了植物根系与土壤的接触面积，能够极大地促进植物对氮、磷、钾等养分的吸收，提高植物抗逆性，改善植物品质[6-7]。张可可等[8]研究表明，科尔沁沙地榆树接种菌根菌剂能够有效提高菌根侵染率、株高、生物量、有机质和全氮质量分数。麻云霞[9]研究表明浑善达克沙地榆孢子密度与pH呈显著正相关，菌根侵染率和全氮、硝酸还原酶呈正相关和pH、物种丰富度呈负相关。同时，郭绍霞等[10]认为，AM真菌群落会受到土壤类型、水分状况、坡向等因素影响，AM真菌受土壤理化性质和植被类型的影响，同时具有时间和空间的异质性。由于植物不同生长阶段对土壤养分及环境状况不同，本试验以科尔沁沙地10、25、40 a榆树林为研究对象，分析不同树龄榆树的孢子密度、菌根侵染率及土壤理化性质，以揭示不同树龄榆树土壤理化性质与菌根侵染率、孢子密度之间的关系。

1 研究区概况

采样地点位于赤峰市翁牛特旗(42°26′～43°25′N，117°49′～120°43′E)，平均海拔695 m。属于典型的中温带大陆性气候，天气多变，冷暖无常，日温差大，有明显的四季之分，年平均气温6.4 ℃，年平均降水量为370 mm，夏季降水量占全年降水量的75%。年日照时间为2 850～3 000 h。无霜期90～140 d。土壤类型主要为栗钙土和风沙土。

2 材料与方法

本试验选取不同树龄(10、25和40 a)的沙地榆林为试验样地，样地土壤类型、立地条件一致，采样时间为2020年8月(植物生长旺盛时期)。每个采样地按树龄设置3块样方(20 m×20 m)，每个样方随机选取生长健壮的15棵植株，3个样地总计45株(每棵植株之间相距10 m以上)，每棵植株按照东西南北4个方位各取一份土样(各50 g)，将这4份(共200 g)土样混匀，以消除植株根际土壤的差异。取样时除去土壤和表层动植物残体后,同时采集植株与适量根部土壤，尽量保证根环境的稳定，在5～30 cm深处采集带有细根的根系，将样品编号装入自封袋。采集的根样和土样立即放到冰箱4 ℃保存，带回实验室。土样过2 mm筛，除去动物残体和石块等杂物。将过筛后的土样放在冰箱-20 ℃保存，用于土壤理化性质的测定。

2.1 土壤理化性质的测定

土壤的pH采用电位法测定[11]；速效磷(AP)采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定[12]；速效钾(AK)采用NH4OAC浸提-火焰光度法测定[13]；速效氮用碱解扩散法[14]；有机质采用重铬酸钾氧化法测定[15]。

2.2 菌根侵染率的测定

取出固定液中的根系，用蒸馏水清洗多次，切成1 cm左右长的根段；然后将根段置于5% KOH溶液中，90 ℃水浴加热脱色60 min；脱色后用蒸馏水冲洗数次再用碱性H2O2软化20 min(根据根的软硬程度调整软化时间)，直至根样软化为止；软化后置于1% HCI溶液中酸化10 min；然后置于用0.12%的台盼蓝染液(250 mL乳酸，250 mL甘油，500 mL水，1.2 mg台盼蓝)于水浴锅中90 ℃染色30 min，最后置于乳酸-甘油(V(乳酸)∶V(甘油)=1∶1)溶液中脱色。脱好色的根段置于载玻片上压片，用网格十字交叉法[16]在光学显微镜下计数，按下面的公式计算菌根侵染率。

2.3 AM真菌孢子的分离

采用湿筛倾析-蔗糖离心法[17-18]从土壤样品中尽可能的分离孢子，具体操作如下：

(1)将干净的孔径(0.880、0.250、0.055 mm的土壤筛子)叠放在一起，孔径由下往上逐渐变大；

(2)称取100 g风干土样放入大烧杯中浸泡30 min，用玻璃棒充分搅拌使土壤松散；

(3)用干净的玻璃棒搅拌后，充分混匀后静置30 s；

(4)将上清液反复冲洗烧杯中的土样，直到上清液变为清澈；

(5)逐层冲洗筛子，收集底层上筛子的杂物到离心机管中，2 000 r/min离心3 min；

(6)取出，倒掉上清液，加入50%的蔗糖溶液，2 000 r/min离心3 mim；

(7)取出，将上清液再倒入干净的0.055 mm土壤筛，用自来水冲洗2～3遍；

(8)将洗净的孢子及杂物冲到培养皿中，在显微镜下用解剖针将孢子集中，然后用吸管把孢子吸取收集。

2.4 AM真菌形态鉴定

将湿筛倾析法得到的孢子或孢子果制片后，在体式显微镜下观察孢子的形态、大小、颜色、孢子的聚集方式、壁的结构等特征，并且参考Schenck et al.[19]的《VA菌根真菌鉴定手册》和国际丛枝菌根真菌保藏中心(INVAM)国际网站(http：//invam.wvu.edu./the-fungi/species-descriptions)在Internet上提供的种的描述及照片，同时参阅近年来发表的文献资料进行AM真菌种类的鉴定。

2.5 数据处理与分析

用Excel 2019和SPSS软件对数据进行统计分析；利用双尾检验的Pearson相关分析法分析各个土壤养分因子与AM菌根侵染率、孢子密度之间的关系。

3 结果与分析

3.1 土壤养分变化情况

分析不同树龄根系土壤理化性质结果表明：随着树龄的增加，酸性增强，pH在7.25～6.03；土壤速效P和速效N质量分数随树龄增加，先减少后增加。土壤速效钾和有机质质量分数随树龄增加呈增加趋势。

3.2 菌根侵染率与孢子密度变化情况

分析不同树龄菌根侵染率发现，菌根侵染率随着树龄的增加呈现增长的趋势，10、25、40 a的菌根侵染率分别为35.28%、42.19%、55.67%。分析不同树龄孢子密度发现，随着树龄的增加，孢子密度不断增大，10、25、40 a沙地榆孢子密度分别为每100 g中有135、152和160个。

3.3 AM真菌种类鉴定及描述

从3个林龄沙地榆根围共分离出AM真菌4属30种(图1)，其中球囊霉属(Glomus)17种，占总数的56.67%，无梗囊霉属(Acaulospora)9种，占总数的30%，盾巨孢囊霉属(Scutellospora)3种，占总数的10%，原囊霉属(Archaeospora)1种，占总数的3.33%。球囊霉属(Glomus)和无梗囊霉属(Acaulospora)为优势属。

1.黑球囊霉(G. melanosporum)；2.摩西球囊霉(G. mosseae)；3.沙荒球囊霉(G. deserticola)；4.缩球囊霉(G. constrictum)；5.层状球囊霉(G. lamellosum)；6.地表球囊霉(G. versiforme)；7.网状球囊霉(G. reticulatum)；8.根内球囊霉(G. intaradices)；9.地球囊霉(G. geosporum)；10.纯黄球囊霉(G. luteum)；11.膨果球囊霉(G. pansihalos)；12.长孢球囊霉(G. dolihosporum)；13.凹坑球囊霉(G. multiforum)；14.近明球囊霉(G. claroideum)；15.晕环球囊霉(G. halonatum)；16.副冠球囊霉(G. coronatum)；17.荫形球囊霉(G. tenebrisum)；18.蜜色无梗囊霉(A. mellea)；19.细凹无梗囊霉(A. scrobiculata)；20.丽孢无梗囊霉(A. elegans)；21.孔窝无梗囊霉(A. foveata)；22.双网无梗囊霉(A. bireticulata)；23.光壁无梗囊霉(A. laevis)；24.瑞士无梗囊霉(A. rehmii)；25.凹坑无梗囊霉(A. excavate)；26.椒红无梗囊霉(A. capsicular)；27.网纹盾巨孢囊霉(S. reticulata)；28.黑色盾巨孢囊霉(S. nigra)；29.红色盾巨孢囊霉(S. erythropa)；30.薄壁原囊霉(A. leptoticha)。

1.球囊霉属(Glomus)

(1)黑球囊霉(Glomus.melanosporum)

孢子表面常附着不匀的薄壁菌丝，黑棕色至黑红棕色，球形至近球形，卵形或椭圆形，大小为165～250 μm。

(2)摩西球囊霉(Glomus.mosseae)

孢壁2层，连孢菌丝单根，在连点处朝连点扩张呈漏斗形，孢子内含物为大小不等的油滴或颗粒，淡黄色至黄棕色深红棕色，圆形、近圆形，大小为100～200 μm。

(3)沙荒球囊霉(Glomus.deserticola)

孢子壁单层，成熟孢子连点处直径5～11 μm，稍呈漏斗状，淡红棕色至深棕色，球形、近球形，大小为90～110 μm。

(4)缩球囊霉(Glomus.constrictum)

连孢菌丝柱状或稍呈漏斗状，通常在连点处骤然弯曲缢缩，孢子内含物为大小不等的油滴和颗粒，深黄棕色至深红棕或黑色，球形至椭圆形，大小为(50～110)μm×(50～120)μm。

(5)层状球囊霉(Glomus.lamellosum)

孢子壁1层，连点处孢壁不增厚；连点缢缩，连孢菌丝常向一侧弯曲，黄至黄棕色，圆、近圆或长圆，大小为130～180 μm。

(6)地表球囊霉(Glomus.versiforme)

孢壁3层，L3破裂后可见，呈亮金黄色，连孢菌丝成熟后脱落，连点直或小喇叭状，黑棕红色，球形至近球形，大小为100～240 μm。

(7)网状球囊霉(Glomus.reticulatum)

孢子表面有较规则的网状纹饰，网状四边形或多边形，连孢菌丝直筒或微漏斗形，无色、淡黄色至淡黄棕色，球形、近球形或不规则形，大小为80～150 μm。

(8)根内球囊霉(Glomus.intaradices)

孢壁3层，最外层L1无色透明，L2在孢子成熟后易被分解成颗粒状或黏孢子，深棕色至黑色，球形至近球形，大小为70～135 μm。

(9)地球囊霉(Glomus.geosporum)

厚垣孢子于土壤中单生，连孢菌丝基部粗硬，可见一层壁，连孢菌丝单根，连丝基部不扩张，浅黄色、深黄色至褐色，球形至近球形，大小为120～145 μm。

(10)纯黄球囊霉(Glomus.luteum)

孢壁4层，都紧贴在一起，只有在幼小孢子里L1和L2存在，否则通常贴在一起，黄色、黄棕色至黑橘色，球形、近球形，大小为60～175 μm。

(11)膨果球囊霉(Glomus.pansihalos)

表面有灰白色薄壁菌丝，连孢菌丝单根，直或弯，连点开放或由L3封闭，L1在乳酸中膨胀，黄棕至红棕色，球形或近球、椭球形，大小为110～190 μm。

(12)长孢球囊霉(Glomus.dolihosporum)

孢子长宽比1.00∶(0.41～0.66)或1.00∶0.77，连孢菌丝黄棕色，椭圆形、长椭圆形、卵形或矩形，大小为(110～220)μm×(65～110)μm。

(13)凹坑球囊霉(Glomus.multiforum)

孢壁2层，连孢菌丝单根，在连点处呈圆筒形或小喇叭形，孢子内含物为颗粒状和油滴，淡黄色至黄棕色，球形、近球形，大小为70～150 μm。

(14)近明球囊霉(G.claroideum)

厚垣孢子于土壤中单生，连孢菌丝圆柱状或稍缩，黄色至黄红色，球形至近球形，大小为125～175 μm。

(15)晕环球囊霉(Glomus.halonatum)

孢壁2层，L1易逝壁，L2为层状壁，黄色或橙色，在Melzer’s试剂中呈深粉色，浅橙黄色至深红黄色，球形或近球形，大小为100～220 μm。

(16)副冠球囊霉(Glomus.coronatum)

孢子于土壤内单生，浅橙黄色到深红色，在Melzer’s试剂中呈深粉色，球形至近球形，大小为100～220 μm。

(17)荫形球囊霉(Glomus.tenebrisum)

孢子单生，圆形或近圆形，黄棕色至深棕色；孢壁2层，外层无色，薄；连孢菌丝1根，基部增厚。

2.无梗囊霉属(Acaulospora)

(18)蜜色无梗囊霉(Acaulospora.mellea)

孢壁3层，L1透明易逝，L2浅黄色至橙棕色层状壁，L3透明，浅橙色或橙黄色，圆形、椭圆形，大小为90～120 μm。

(19)细凹无梗囊霉(Acaulospora.scrobiculata)

表面有凹坑形纹饰，凹坑为圆形、长形或多角形，有时密集有时稀疏，布满孢子表面，淡黄色至黄褐色，圆形、近圆形，大小为90～135 μm。

(20)丽孢无梗囊霉(Acaulospora.elegans)

孢壁2层，L1透明，L2层状壁；突起上覆盖有齿槽形网格纹饰，黄棕色，球形至近球形，大小为(140～280)μm×(145～330)μm。

(21)孔窝无梗囊霉(Acaulospora.foveata)

孢壁3层，孢子表面有双层网纹，网孔呈多角形，孢子中含有透明的小油滴，球形至椭圆形，浅黄色至杏黄色，球形至椭圆形，大小为240～320 μm。

(22)双网无梗囊霉(Acaulospora.bireticulata)

孢壁2层，L1透明，L2层状壁；突起上覆盖有齿槽形网格纹饰，浅褐色或褐色，球形至椭圆形，大小为(120～150)μm×(140～180)μm。

(23)光壁无梗囊霉(Acaulospora.laevis)

孢壁3层，L1透明光滑，L2浅黄色至暗黄棕色层状璧，L3浅黄棕色，浅黄至黑红棕色，球形，在Melzer’s试剂中特异性反应不明显。

(24)瑞士无梗囊霉(Acaulospora.rehmii)

孢子无柄，外表有迷宫似的纹饰。在Melzer’s试剂中呈红色，浅黄棕色，球形、近球。

(25)凹坑无梗囊霉(Acaulospora.excavate)

表面有圆至近圆形大凹坑纹饰，有碎屑，球形或近球形，大小为100～195 μm。

(26)椒红无梗囊霉(Acaulospora.capsicular)

球形至近球形，橘红色至辣椒红，大小为80～150 μm。

3.盾巨孢囊霉属(Scutellaspora)

(27)网纹盾巨孢囊霉(Scutellaspora.reticulata)

L1有突起的四至八边形的网格覆盖，网格上有圆锥形的刺，橘红色至黑红色，圆形至近球形，大小为380～430 μm。

(28)黑色盾巨孢囊霉(Scutellaspora.nigra)

孢子表面上有内陷小孔，且大小形状不均匀，重叠在一起构成环状饰物，黑色或深棕色，近球形，大小为297～500 μm。

(29)红色盾巨孢囊霉(Scutellaspora.erythropa)

厚垣孢子于土壤中单生，孢壁5层，L1、L2为单一壁，光泽度高；L3膜状；L4层状壁；在Melzer’s试剂中，L5紫红，近球形，黄棕色，大小为220 μm×210 μm。

4.原囊霉属(Archaeospora)

(30)薄壁原囊霉(Archaeospora.leptoticha)

球形至椭圆形，浅褐色或褐色，孢子表面常有一些附着物或呈脱斑状，有些还具有不明显的网状饰物，大小为(20～150)μm×(40～180)μm。

3.4 孢子密度和菌根侵染率与土壤因子的相关性

除速效N和速效P外，其他土壤因子及菌根侵染率均与树龄呈显著相关。孢子密度和菌根侵染率与pH显著负相关，与有机质和速效钾显著相关(表1)。

表1 土壤因子与根系侵染率和孢子密度的相关性

4 讨论与结论

国内外很多学者对树龄和菌根状况的关系做了大量的研究，崔莉娜等[20]研究我国杉木林孢子密度与菌根侵染率与林龄显著正相关。陈雪冬等[21]研究黄土高原地区刺槐纯林的孢子密度和菌根侵染率随着树龄的增加而增加。与本试验研究结果一致，其原因可能是老龄根系统具有较多且发达的细根，并且有大量孢壁细胞和发达的细胞间隙，因而表层阻力小，更有利于AM真菌的侵染。并且对榆树而言，随树龄的增加其侧根和须根的数量增加，为AM真菌提供了更多的侵染位点，因此侵染率随着树龄的增加而上升。

研究发现，土壤pH随树龄的增加酸性增强，这与崔莉娜等[20]研究结果一致。原因主要是榆树根系分泌物的长期累积、凋落物的堆积和腐蚀均可导致根系土壤酸化。N、P质量分数随着树龄的增加先降低后增加，这可能是榆树在中龄阶段属于速生和杆材阶段[21]，植物对土壤养分的需求大，该阶段土壤微生物数量和活性较低使得凋落物对N、P元素的归还较少导致的[22]。在过去的研究中速效K质量分数随树龄变化的结果并不一致，林希昊等[23]研究表明随着橡胶林树龄增加速效K质量分数有逐渐减少的趋势，而本文速效K质量分数随树龄的增加而增加的结果与张社奇等[24]研究结果一致，可能是土壤中K元素质量分数较少，随着树龄的增加，土壤微生物增多，促进了难溶、无效的矿物态钾向水溶性及交换性钾交换。有机质质量分数随着树龄的增加呈现先减少后增加的趋势，与蔡葵等[25]研究结果一致，原因可能是榆树在幼龄阶段凋零物和其他分解量相对较少，自身生长发育需要吸收量较多导致有机质质量分数较低，随着树龄的增加，枯落物、植物残体等分解成有机质，且榆树生长末期对有机质的吸收减少，导致有机质的质量分数逐渐升高。

本研究发现，榆树生长状况的影响因子也与树龄有关。具体而言，10年生榆树林光合能力强，各器官生长代谢活跃，可以充分的利用自身和土壤养分来满足自身的生长需求，因此AM作用并不明显；25年生榆树正处于生长旺盛阶段，随着林分密度增大，种内竞争激烈，此时榆树生长较快，根系向土层深处生长，给AM提供了生长的场所；榆树生长40 a，此时榆树根系发达，土壤中具有丰富的外延菌丝网[8]，扩大了根系的吸收范围，此时是AM充分发挥作用的阶段。

本试验结果表明：不同树龄沙地榆树根系均能与AM真菌形成良好的共生关系。孢子密度和菌根侵染率均为40年生最高。从沙地榆根围共分离出AM真菌4属30种，球囊霉属(Glomus)17种，无梗囊霉属(Acaulospora)9种，盾巨孢囊霉属(Scutellospora)3种，原囊霉属(Archaeospora)1种，其中球囊霉属(Glomus)为主要优势菌。不同树龄沙地榆树根际土壤pH、速效P、速效N、速效K、有机质存在差异。随着树龄的增加速效K与有机质呈现增长的趋势，pH呈现降低趋势，速效P和速效N质量分数先降低后增加。这为筛选AM真菌资源，利用菌根技术提高沙区榆树抗逆性等方面奠定了基础。